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辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶裂解酶基因克隆及功能研究

作　者: 付丽
导　师: 张修国
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 辣椒疫霉果胶裂解酶基因家族瞬时表达基因沉默过量表达致病性测定
分类号: S436.418.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

辣椒疫病(Pepper Phytophthora Blight)是世界范围内普遍发生的一种土传病害,能侵染包括辣椒、西红柿、茄子、黄瓜、南瓜和甜瓜等在内的多种茄科及葫芦科植物。1922年,Leon Leonian首次报道了其在美国新墨西哥州辣椒作物上的危害,并将其病原命名为Phytophthora capsici。辣椒疫霉菌以卵孢子或厚垣孢子在土壤的病残体中越冬,可以存活数月至更长时间,在适宜条件下引起茎腐、根腐和枯萎,寄主范围广,给我国及世界各国农业生产造成巨大的经济损失。由于辣椒疫霉菌株具有较强的变异性,培育抗病品种效果不理想,一直以来辣椒疫病的防治以化学防治为主,带来的后果就是农药残留和环境污染。因此,探索辣椒疫霉菌重要致病因子,研究病原菌抗病性生理生化机制,结合抗病性遗传、抗病基因定位与基因工程,进行抗病性鉴定和抗病育种方面研究成为病害防治的前景。植物病原菌与寄主互作过程中,植物自身形成了一系列复杂的防御系统,病原物要想侵染寄主必须克服寄主的防卫系统,从寄主中获取养分才能进行繁殖并扩大侵染。因此在侵染过程中病原菌分泌多种细胞壁降解酶或致病酶类,破坏植物的防御系统,包括：角质酶(cutinase),果胶酶(pectinase),纤维素酶(cellulase),半纤维素酶(hemicellulase)和蛋白酶(protease)等。PEL(Pectate Lyase),是一种典型的果胶降解酶,又称pectate ranseliminases,由β消去反应裂解α-1,4糖苷键,在反应产物的非还原端残基C-4和O-5之间产生一个双键。可裂解高度酯化的果胶,能迅速降低粘度。许多真菌、细菌及卵菌的侵染过程都可以产生果胶裂解酶,卵菌中的疫霉属基因组存在大量的果胶裂解酶基因,对于大量的基因信息区分主要的致病靶基因,进而解释重要致病靶基因的功能及其在寄主侵染过程中的作用,显得极为重要。本研究对高致病辣椒疫霉菌株SD33内Pcpel基因家族的致病遗传机制及其功能进行了分析。具体内容如下：(1)辣椒疫霉菌高致病菌株SD33内Pcpel基因克隆及生物信息学分析。首先对辣椒疫霉基因组序列进行生物信息学分析,特别分析了基因组内Pcpel基因家族信息。以高致病辣椒疫霉菌株SD33为材料,结合已得到的13个Pcpel序列,利用同源序列法克隆了该菌株内其他9个Pcpel基因并进行BLAST分析；利用DNAman软件对克隆的序列进行比对,发现辣椒疫霉的PEL蛋白基因序列在总长上显示了相对高的差异,序列分为两种结构域,同属于果胶裂解酶家族；但仍有保守的区域存在,该部分的保守残基于催化功能有关；大部分序列都含有信号肽和糖基化位点。最后利用构建进化树的方法选取了12个基因进行了功能分析。(2)辣椒疫霉Pcpel基因在病原-寄主互作过程中的表达模式分析。利用游动孢子悬浮液接种离体辣椒叶片,在接种后1d、3d、5d、7d取样,然后提取发病叶片总RNA。反转录后用qRT-PCR分析12个候选基因在辣椒疫霉侵染寄主过程中的表达模式。实验结果显示12个PEL基因的表达模式基本一致,其表达量都是逐渐上升的趋势,都在第7d的表达量最高,也就是后期达到峰值。这说明PEL蛋白在病原侵染的后期阶段强烈表达,病原与植物防御系统后期反应Pcpel的作用力较大。辣椒疫霉果胶裂解酶基因家族的成员在侵染后期参与克服植物防御反应,在致病过程中起到重要作用。(3)辣椒疫霉Pcpel基因在植物体内的功能分析。将12个Pcpel基因,分别构建了PVX表达载体,然后转化农杆菌进行瞬时表达。利用农杆菌侵染法接种本氏烟和辣椒叶片。记录每个基因表达后所引起两种植物症状变化。结果显示本氏烟和辣椒的叶片症状不同,并且各个基因成员在同一种植物上表达后的症状也有较大差异；其中接种本氏烟的叶片大多出现褪绿症状,黄化症状不明显,个别基因接种没有引起植物防卫反应；而接种的辣椒叶片症状比较明显,除了产生褪绿黄化症状外,个别基因(Pcpel1、Pcpel16和Pcpel20)的表达还出现了大面积连片的黑褐色病斑症状。这说明了Pcpel家族成员基因拥有果胶裂解酶的作用,但是不同Pcpel基因差异性较大(4)沉默突变体的构建及基因沉默现象的分析。借助PEG介导的原生质体转化方法,得到了12个沉默突变体菌株,实现了12个候选基因的沉默。根据载体pHAM34酶切位点及各基因序列设计基因特异性引物,将基因序列反向插入载体,构建了12个候选基因的沉默载体。将重组质粒及标记质粒pHspNpt共同转入辣椒疫霉SD33原生质体,利用抗生素G418筛选转化子。得到的转化子在V8培养基上生长并记录生物性状,包括菌丝生长速率、菌丝形态、游动孢子产率等。同时提取转化子菌体总RNA,反转录后,荧光定量PCR分析各候选基因在各转化子内的沉默效率。结果显示,12个转化子中除了Pcpel15、Pcpel18、和Pcpel20外,其余9个基因的沉默效率都在70%以上,没有出现多个基因在同一个转化子内共沉默的现象,这可能是相关基因同源性较低,没有发生染色体异染色质化的原因。此外,基因沉默并没有引起疫霉菌株生物性状的变化。(5)过量表达突变体的构建及过量表达的影响。借助PEG介导的原生质体转化方法,得到了12个过量表达突变体菌株,实现了12个候选基因的过量表达。引物设计及载体同沉默方法相同,将基因正向插入载体,构建了12个基因的过量表达载体。得到的转化子在V8培养基上生长并记录生物性状,包括菌丝生长速率、菌丝形态、游动孢子产率等。同时提取转化子菌体总RNA,反转录后,荧光定量PCR分析各候选基因在各转化子内的过量表达效率。结果显示,12个转化子中除了Pcpel17和Pcpel19外,其余10个基因的相对过量表达效率都在25倍以上,没有出现多个基因在同一个转化子内共过量的现象。此外,基因过量表达并没有引起疫霉菌株生物性状的变化。(6)转化子的致病性检测。利用游动孢子接种方法处理辣椒幼苗叶片,以野生型菌株为对照,记录叶片发病情况及病斑大小。分析结果发现沉默突变体的致病力发生变化,Pcpel1、Pcpel16、Pcpel20病斑明显减小,其他基因的变化较小,Pcpell1的接种基本没有变化。过量表达的结果表明,大部分的基因过量表达转化子接种病斑面积没有明显加大,只有Pcpel16、Pcpel20的病斑面积加大,病斑出现时间提前,比沉默转化子接种发病面积明显增加。Pcpel1过量表达的接种面积反而变小,说明这个基因的过量表达影响了菌体的致病性,可能是致病过程中的关键基因。综合实验说明部分PEL基因沉默或过量表达导致菌株致病力发生变化,大部分基因没有影响菌体的致病性,而且Pcpel1、 Pcpel16、Pcpel20是辣椒疫霉中在病原侵染过程中起到重要作用的PEL。综合所有实验结果,我们认为辣椒疫霉果胶裂解酶基因是以基因家族形式存在的,在寄主与病原互作过程中扮演着重要角色。辣椒疫霉果胶裂解酶不仅能使植物产生常见的褪绿、黄化,还会引起寄主叶片细胞壁完全失去防御能力,导致细胞死亡,组织坏死的能力。基因家族各成员功能存在较大差异,即使功能域相同的基因之间也可能存在巨大的功能差异,对基因家族功能的研究不能局限于个别基因功能的分析。Pcpel基因沉默不会引起菌株表型变化但会导致转化子致病力明显降低。此外很难实现基因家族单一成员或者全部成员基因沉默,但是并不影响对该类基因功能的分析。将该家族12个基因进行稳定沉默以及致病性分析,发现该家族部分成员沉默会导致菌株致病性降低。利用稳定基因沉默对于基因家族成员功能的研究是个很好的选择。

全文目录

符号说明  6-8
目录  8-13
中文摘要  13-16
Abstract  16-19
1 文献综述  19-68
  引言  19-20
  1.1 辣椒疫病的发生与防治  20-26
    1.1.1 辣椒疫病的危害及主要症状  20-21
    1.1.2 辣椒疫病的病原学研究  21-22
    1.1.3 辣椒疫霉的生理分化  22-23
    1.1.4 辣椒疫病的防治  23-25
      1.1.4.1 田间管理  23
      1.1.4.2 化学防治  23-24
      1.1.4.3 生物防治  24-25
    1.1.5 辣椒疫病的防治存在的问题  25-26
  1.2 植物病原真菌致病基因的研究现状  26-33
    1.2.1 与侵染结构产生有关的基因  26-27
    1.2.2 与角质层及细胞壁降解有关的基因  27-28
    1.2.3 与信号传导有关的基因  28-29
    1.2.4 与寄主代谢反应相关的基因  29-31
    1.2.5 真菌毒素类  31-32
    1.2.6 其它致病基因  32-33
  1.3 辣椒疫病的抗性遗传与抗病基因研究进展  33-35
    1.3.1 辣椒抗疫病的遗传特点  33-34
    1.3.2 抗疫病基因的分子标记与QTL定位  34-35
  1.4 果胶酶的研究进展  35-39
    1.4.1 果胶  35-36
    1.4.2 果胶酶  36-38
      1.4.2.1 果胶酶的分布  36-37
      1.4.2.2 果胶酶类型上的分化  37-38
    1.4.3 果胶酶的分子生物学研究  38
    1.4.4 果胶酶在致病过程中的作用  38-39
  1.5 果胶裂解酶的研究进展  39-47
    1.5.1 果胶裂解酶(PEL)的存在与来源  40
    1.5.2 果胶裂解酶的分子量及分子组成  40
    1.5.3 对果胶裂解酶结构的研究  40-42
    1.5.4 果胶裂解酶的性质与作用机理  42-43
    1.5.5 果胶裂解酶分子生物学研究  43-47
      1.5.5.1 果胶裂解酶在细菌上的研究进展  43-44
      1.5.5.2 果胶裂解酶在真菌上的研究进展  44-45
      1.5.5.3 果胶裂解酶在植物上的研究进展  45-46
      1.5.5.4 果胶裂解酶在线虫上的研究进展  46
      1.5.5.5 果胶裂解酶在疫霉上的研究进展  46-47
  1.6 农杆菌介导的基因瞬时表达体系  47-49
    1.6.1 瞬时表达的优点  47-48
    1.6.2 农杆菌瞬时表达的原理  48
    1.6.3 PVX表达载体  48-49
  1.7 基因沉默技术及其机理  49-55
    1.7.1 基因沉默现象的发现  49-50
    1.7.2 基因沉默机理  50-55
      1.7.2.1 转录水平的基因沉默  50-53
      1.7.2.2 转录后水平的基因沉默  53-55
  1.8. 基因沉默技术在真菌基因功能研究中的应用  55-59
    1.8.1 RNAi在真菌基因功能研究中的策略  56-58
      1.8.1.1 发夹结构RNA介导的RNAi  56
      1.8.1.2 利用反向双元启动子载体介导的RNAi  56-57
      1.8.1.3 直接转入dsRNA或siRNA介导的RNAi  57-58
    1.8.2 RNA干扰技术和基因敲除技术的优缺点比较及分析  58-59
  1.9 卵菌基因沉默研究进展  59-68
    1.9.1 卵菌沉默机制  60-61
    1.9.2 卵菌稳定沉默  61-62
    1.9.3 卵菌瞬时基因沉默  62-63
    1.9.4 基因沉默与表型变化的关系  63
    1.9.5 卵菌中遗传转化体系的建立  63-66
      1.9.5.1 选择性标记  64
      1.9.5.2 原生质体转化(protoplast transformation)  64-65
      1.9.5.3 农杆菌转化(agrobacterium-mediated transformation)  65-66
      1.9.5.4 粒子轰击方法转化(transformation by bombardent)  66
      1.9.5.5 电转化(electroporation)  66
    1.9.6 卵菌中基因沉默技术的应用及发展  66-68
2. 材料方法  68-91
  2.1 材料  68-71
    2.1.1 辣椒疫霉菌株  68
    2.1.2 菌株与质粒  68
    2.1.3 酶和生化试剂  68
    2.1.4 仪器  68
    2.1.5 培养基  68-69
    2.1.6 溶液配制  69-71
  2.2 实验方法  71-91
    2.2.1 辣椒疫霉基因组果胶裂解酶(PEL)基因信息分析  71
    2.2.2 辣椒疫霉菌株SD33果胶裂解酶基因家族成员克隆  71-73
      2.2.2.1 基因克隆引物设计  71-72
      2.2.2.2 辣椒疫霉DNA提取  72
      2.2.2.3 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel基因克隆  72-73
    2.2.3 辣椒疫霉菌株SD33果胶裂解酶(PcPEL)基因家族系统进化分析  73-74
    2.2.4 辣椒疫霉菌株SD33果胶裂解酶基因家族成员在菌丝体内表达  74-76
      2.2.4.1 辣椒疫霉菌株SD33总RNA的提取和cDNA的合成  74-75
      2.2.4.2 紫外检测RNA产率和纯度  75
      2.2.4.3 反转录cDNA第一链的合成  75
      2.2.4.4 RT-PCR  75-76
    2.2.5 辣椒疫霉菌株SD33果胶裂解酶(Pcpel)基因家族成员在病原寄主互作过程中表达模式分析  76-80
      2.2.5.1 接种辣椒叶片  77
      2.2.5.2 受试辣椒叶片总RNA的捉取(Trizol法)  77
      2.2.5.3 RNA紫外检测及反转录  77
      2.2.5.4 荧光定量PCR  77-80
    2.2.6 辣椒疫霉菌株SD33果胶裂解酶基因在植物体内瞬时表达  80-85
      2.2.6.1 农杆菌瞬时表达载体构建引物设计  80-82
      2.2.6.2 辣椒疫霉果胶裂解酶瞬时表达载体构建  82-83
      2.2.6.3 辣椒疫霉果胶裂解酶瞬时表达载体农杆菌转化  83-84
      2.2.6.4 辣椒疫霉果胶裂解酶农杆菌瞬时表达接种辣椒和烟草  84-85
    2.2.8 辣椒疫霉菌株SD33果胶裂解酶(Pcpel)基因稳定沉默和过量表达  85-89
      2.2.8.1 卵菌稳定转化载体构建引物设计  85-86
      2.2.8.2 辣椒疫霉果胶裂解酶稳定沉默表达和过量表达载体构建  86-87
      2.2.8.3 辣椒疫霉果胶裂解酶稳定沉默和过量表达重组载体质粒提取  87-88
      2.2.8.4 辣椒疫霉菌转化步骤  88-89
    2.2.9 辣椒疫霉基因沉默和过量表达转化子的筛选和分子验证  89
    2.2.10 辣椒疫霉Pcpel基因沉默和过量表达转化子筛选及其生物学性状分析  89-91
      2.2.10.1 游动孢子诱导  89
      2.2.10.2 转化子表型分析  89-90
      2.2.10.3 致病性测定  90-91
3 结果与分析  91-119
  3.1 辣椒疫霉Pcpel基因克隆  91-102
    3.1.1 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel14基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  91-92
    3.1.2 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel15基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  92-93
    3.1.3 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel16基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  93-95
    3.1.4 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel17基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  95
    3.1.5 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel18基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  95-96
    3.1.6 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel19基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  96-97
    3.1.7 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel20基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  97-98
    3.1.8 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel21基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  98-99
    3.1.9 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel22基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析  99-102
  3.2 辣椒疫霉Pcpel基因系统进化分析  102-105
    3.2.1 22个Pcpel基因序列比对  102-104
    3.2.2 22个Pcpel基因系统进化分析  104-105
  3.3 Pcpel基因在辣椒疫霉菌体内表达分析  105-106
  3.4 Pcpel基因在辣椒疫霉与寄主互作中表达模式分析  106-108
  3.5 辣椒疫霉果胶裂解酶基因农杆菌瞬时表达  108-111
    3.5.1 Pcpel基因PVX载体构建及农杆菌转化  108-109
    3.5.2 Pcpel基因农杆菌转化子在辣椒体内瞬时表达  109-110
    3.5.3 Pcpel基因农杆菌转化子在烟草体内瞬时表达  110-111
  3.6 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel基因稳定沉默和过量表达突变体的获得  111-114
  3.7 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel沉默和过量表达转化子表型分析  114-116
  3.8 辣椒疫霉果胶裂解酶Pcpel沉默及过量表达转化子致病性测定  116-119
    3.8.1 Pcpel沉默转化子致病性测定  116-118
    3.8.2 Pcpel过量表达转化子致病性测定  118-119
4. 结论与讨论  119-128
  4.1 辣椒疫霉基因组信息分析  119
  4.2 辣椒疫霉果胶裂解酶基因确定  119-121
  4.3 辣椒疫霉12个果胶裂解酶基因在病原与寄主互作过程中表达模式异同  121-122
  4.4 辣椒疫霉12个果胶裂解酶基因PVX表达后农杆菌接种症状差异  122-123
  4.5 辣椒疫霉果胶裂解酶基因沉默和过表达  123-124
  4.6 辣椒疫霉果胶裂解酶基因沉默和过量表达突变体致病力变化  124-126
  4.7 结论  126-128
参考文献  128-148
附录  148-149
致谢  149-150
攻读博士学位期间发表文章  150

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶裂解酶基因克隆及功能研究

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