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尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种T-DNA插入突变体库的构建及部分致病相关突变体插入位点的定位

作　者: 高剑
导　师: 曾会才
学　校: 海南大学
专　业: 植物病理学
关键词: 香蕉枯萎病菌4号生理小种 T-DNA插入致病性测定侧翼序列
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 93次
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内容摘要

香蕉枯萎病是一种系统性维管束病害,用化学农药很难防治,又因为其传播容易且速度快,给香蕉种植业带来毁灭性打击。本研究首先从海南省不同市县采集不同地理来源的香蕉枯萎病菌4号小种,通过经典病理学与分子生物学的方法对这些香蕉枯萎病的病原进行了鉴定；经过致病性测定后发现不同来源的菌株致病性方面存在差异,并从中筛选出致病性强且生长旺盛的菌株193-6作为插入突变的原始野生型菌株。在进行突变体库的构建之前,优化了农杆菌介导的该生理小种的转化体系,优化后4号生理小种的转化效率达到700-800个转化子／106个香蕉枯萎病菌孢子。PCR验证表明外源的T-DNA已经成功地整合到病原菌基因组中。应用该转化体系已建立了包含2520个转化子的突变体库,并且已经完成了所有转化子的单孢分离、致病性测定以及部分致病性变化显著突变体的侧翼序列克隆工作。取得的研究结果如下：1、从海南省不同市县采集到具有香蕉枯萎病症状的香蕉假茎材料,分离纯化得到17株香蕉枯萎病菌,经显微观察、分子检测以及柯赫法则鉴定后确定17株病原菌均为香蕉枯萎病菌,其中10株为香蕉枯萎病菌4号生理小种菌株,7株为1号生理小种。从这些4号生理小种菌株中挑取致病力和生活力都较强的单孢菌株193-6,用作T-DNA插入遗传转化的野生型菌株。2、大规模构建突变体库前,对ATMT转化条件进行了优化,优化后的转化体系转化效率非常高。优化后的最佳条件分别是：诱导剂AS的浓度为150μmol／mL,AS诱导前IM培养基中的农杆菌浓度OD600为0.15,农杆菌经IM液体培养基AS诱导的时间为7个小时,Focr4孢子浓度为1×107个／mL,培养温度为25℃,诱导培养基pH值为5.5,共培养时间为48小时。3、通过潮霉素抗性筛选,获得抗性遗传稳定的突变菌株2520个,本实验对2520个转化子进行了单孢分离及致病力的检测。4、通过致病性测定方法的摸索,找到了首先离体叶片粗筛,组培苗复筛,大田实验最后确认突变体致病性变化的高通量突变体致病性测定方法。5、通过致病性测定筛选,共获得致病性丧失突变体3个,致病性严重减弱突变体7个,致病性减弱突变体11个,致病性加强突变体4个,致病性极度加强突变体1个以及形态上明显变化的突变体若干。6、通过DW-ACP的方法,可以很简便高效地扩增插入的侧翼序列。本实验共获得18个香蕉枯萎病菌4号生理小种致病性变化突变体侧翼序列,并通过此侧翼序列与Focr4全基因组序列进行比对,可以获得T-DNA插入位点的具体信息。

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种T-DNA插入突变体库的构建及部分致病相关突变体插入位点的定位

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