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噻嗪酮降解菌株YL-1的分离鉴定、代谢途径及应用研究

作　者: 李超
导　师: 李顺鹏
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 噻嗪酮分离鉴定生物降解代谢途径土壤修复
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

噻嗪酮(buprofezin)是一种使用比较广泛的杀虫剂,其在环境中的迁移、转化和分解等环境行为及其对人类健康的潜在危害正日益受到关注,分离筛选能降解噻嗪酮的微生物并研究其降解机制具有非常重要的理论和应用价值。从长期受噻嗪酮污染的水稻田土壤中分离筛选获得一株能够高效降解噻嗪酮的菌株YL-1。根据YL-1的表型特征、生理生化特性以及16S rDNA同源性比较,将其鉴定为红球菌属Rhodococcus sp.(GenBank Accession No. JF937542)。菌株YL-1在pH值为6.0-9.0时,生长良好,最适生长初始pH为7.0,最适生长温度为30℃。菌株YL-1的最适生长碳源为葡萄糖；最适生长氮源为酵母膏,在无机氮源中,菌株YL-1对硝酸铵的利用最好。菌株YL-1能够以噻嗪酮为唯一碳源和氮源生长。在温度30℃和接种量5%的条件下,菌株YL-1在含50mg L-1噻嗪酮的无氮无机盐培养基中48h内的降解率达90%以上。菌株YL-1降解噻嗪酮的最适温度为30℃,最适pH为7.0。菌株YL-1对高浓度的噻嗪酮降解较慢且降解效率较低浓度时差,在噻嗪酮浓度为200mg L-1时降解率仅为32.8%。对菌株YL-1代谢噻嗪酮途径的初步研究表明,其可能首先将噻嗪酮裂解为2-叔丁基亚氨基-3-异丙基-1,3,5-噻二嗪-4-酮和邻苯二酚,前者再进一步转化为N-叔丁基-硫代甲亚胺酸甲酰胺甲酯,叔丁基异硫氰酸酯和异硫氰酸异丙酯。为了进一步研究菌株YL-1对噻嗪酮的代谢途径,我们将菌株YL-1菌体分别用外源添加物进行诱导,同时设空白对照,结果显示噻嗪酮能够显著地诱导邻苯二酚-2,3-双加氧酶的活性,表明邻苯二酚-2,3-双加氧酶参与了菌株YL-1降解噻嗪酮的过程,也间接证明了噻嗪酮在降解起始其苯环可能先转化为邻苯二酚。研究了菌株YL-1对噻嗪酮污染土壤的修复作用。噻嗪酮浓度为10mg kg-1干土,菌株YL-1接种量为108个g-1干土时,第25d土壤中噻嗪酮降解率为85.3%；而未接种降解菌土壤中噻嗪酮降解率仅为12.1%；同时在25d后,仍然能够检测出投加到土壤中的菌株YL-1(1.9×107个g-1),表明投加外源降解菌YL-1可显著提高土壤中噻嗪酮的降解速率,且菌株YL-1可以在自然环境下存活较长的时间。菌株YL-1的接种量减少为105个g-1干土时,接种菌株YL-1对土壤中噻嗪酮降解无显著促进作用。土壤中初始噻嗪酮浓度为50mgkg-1时,菌株YL-1对噻嗪酮的降解率仅为40.6%。菌株YL-1在土壤中降解噻嗪酮的最适温度是30℃。土壤中添加葡萄糖和有机肥料可以提高菌株YL-1降解噻嗪酮的速率。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
符号与缩略语说明  11-12
前言  12-13
第一章文献综述  13-27
  1 噻嗪酮概述  13-16
    1.1 噻嗪酮的理化性质  13-14
    1.2 噻嗪酮的杀虫机理及使用情况  14
    1.3 噻嗪酮的毒性  14
    1.4 噻嗪酮残留的情况及相关标准  14-15
    1.5 噻嗪酮的检测方法  15-16
  2 噻嗪酮的降解研究  16-22
    2.1 噻嗪酮在植物体内的代谢研究  16-17
    2.2 噻嗪酮在动物体内的代谢研究  17-19
    2.3 噻嗪酮在土壤和水体中的代谢研究  19
    2.4 噻嗪酮的微生物代谢研究  19-22
  参考文献  22-27
第二章噻嗪酮降解菌的分离、鉴定及其生物学特性研究  27-41
  1 材料与方法  27-30
    1.1 培养基与试剂  27-28
    1.2 噻嗪酮降解菌的分离  28
    1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定  28
    1.4 降解菌株16S rRNA基因序列的测定  28-29
    1.5 降解菌株系统发育地位的确定  29-30
    1.6 菌体生长量的测定  30
    1.7 噻嗪酮的含量测定  30
  2 结果与分析  30-38
    2.1 噻嗪酮降解菌株的分离  30-32
    2.2 降解菌株YL-1的菌落形态及生理生化特征  32
    2.3 菌株YL-1的16SrRNA基因扩增  32-33
    2.4 降解菌株YL-1的鉴定结果  33-34
    2.5 环境条件对降解菌株YL-1生长的影响  34-37
    2.6 菌株YL-1的抗性谱  37-38
  3 小结  38-39
  参考文献  39-41
第三章噻嗪酮降解菌的降解特性及代谢途径研究  41-61
  第一节菌株YL-1降解噻嗪酮的特性研究  41-46
    1 材料与方法  41-42
      1.1 供试菌株、培养基与试剂  41
      1.2 菌体生长量的测定  41
      1.3 噻嗪酮的含量测定  41-42
      1.4 菌株YL-1降解底物谱  42
      1.5 种子液培养  42
    2 结果与分析  42-46
      2.1 菌株YL-1的生长与噻嗪酮降解的关系  42-44
      2.2 噻嗪酮起始浓度对YL-1降解噻嗪酮的影响  44
      2.3 温度对菌株YL-1降解噻嗪酮的影响  44-45
      2.4 pH对菌株YL-1降解噻嗪酮的影响  45-46
    3 小结  46
  第二节菌株YL-1降解噻嗪酮的途径分析  46-60
    1 材料与方法  46-47
      1.1 培养基、试剂与仪器  46
      1.2 代谢产物提取  46
      1.3 代谢产物检测  46-47
      1.4 外源添加物对YL-1的诱导及粗酶液的制备  47
      1.5 双加氧酶的酶活测定  47
    2 结果与分析  47-59
      2.1 噻嗪酮代谢产物的HPLC初步检测  47-50
      2.2 GC-MS和HPLC-MS分析  50-57
      2.3 外源添加物对YL-1诱导的酶活分析  57-58
      2.4 代谢途径的推测  58-59
    3 小结  59-60
  参考文献  60-61
第四章降解菌YL-1对噻嗪酮污染土壤生物修复作用的研究  61-71
  1 材料与方法  61-63
    1.1 供试菌株、试剂与培养基  61
    1.2 供试土壤  61-62
    1.3 降解菌剂的制备  62
    1.4 土壤中残留噻嗪酮的测定  62
    1.5 土壤降解实验  62
    1.6 不同接种量对土壤中噻嗪酮降解的影响  62-63
    1.7 不同初始噻嗪酮浓度对土壤中噻嗪酮降解的影响  63
    1.8 不同温度对土壤中噻嗪酮降解的影响  63
    1.9 添加外源有机物对土壤中噻嗪酮降解的影响  63
  2 结果与分析  63-68
    2.1 菌株YL-1对土壤中噻嗪酮的降解效果  63-65
    2.2 不同接种量对土壤中噻嗪酮降解的影响  65-66
    2.3 不同初始浓度对土壤中噻嗪酮降解的影响  66
    2.4 不同温度对土壤中噻嗪酮降解的影响  66-67
    2.5 添加外源有机物对土壤中噻嗪酮降解的影响  67-68
  3 小结  68-69
  参考文献  69-71
全文总结  71-73
硕士论文创新点  73-75
附录一文中所用培养基及试剂配方  75-77
附录二相关DNA序列  77-79
攻读硕士学位期间发表或己接收的论文  79-81
致谢  81

噻嗪酮降解菌株YL-1的分离鉴定、代谢途径及应用研究

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