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长蛇鲻鱼肉蛋白制备分离降血压肽研究

作　者: 伍善广
导　师: 廖丹葵
学　校: 广西大学
专　业: 化学工艺
关键词: 长蛇鲻 降血压肽 分离纯化 结构鉴定 金属离子亲和色谱
分类号: TQ464
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


海洋生物蛋白是不同结构功能物质的理想、丰富的贮库,尤其是一些海洋低值鱼类是制备生物活性肽理想的初始原料。以海洋低值鱼类为原料制备、分离降血压肽正成为当今一个研究热点。长蛇鲻(Saurida elongata),长蛇鲻属,狗母鱼科,主要分布于西北太平洋,为广西北部湾经济鱼类之一。本实验以长蛇鲻为原料,蛋白组成分析显示长蛇鲻是一种高蛋白原料,湿基粗蛋白15.34%,干基粗蛋白78.35%,含有18种氨基酸,氨基酸总含量达到791.41mg·g-1,其中8种人体必需氨基酸占总量的44.92%,非极性、疏水性氨基酸39.13%,极性氨基酸占总含量的60.87%。本实验选用六种蛋白酶水解长蛇鲻鱼肉蛋白,通过体外ACE抑制活性测定,筛选中性蛋白酶作为制备血管紧张素转化酶抑制肽(ACEI)的蛋白酶,其酶解产物对ACE抑制活性IC50为0.182mg·mL-1。以水解度DH(Y1)和产物对ACE抑制率IP(Y2)双指标为参数,采用响应面设计法考察了酶解温度、pH值、酶/底(E/S)对水解度及抑制率的影响,优化得到二元多次方程：Y1=23.77-0.81X1+3.21X2-1.65X3-0.84X1X2-0.35X1X3-0.95X2X3-1.76X12-0.99X22-0.33X32；Y2=83.32-2.27X1+2.94X2-2.02X3-0.33X1X2-1.76X1X3+1.64X2X3-3.35X12-3.39X22-2.30X32,并确定了最适酶解工艺条件为：E/S为10000U-g-1、温度为48℃、pH为7.0及水解时间120min,在此工艺条件下水解度为24.07%,ACE抑制率为84.00%。利用超滤(UF)和凝胶层析(GFC)对酶解物进行初步分离。酶解物经超滤分离后活性组分得到富集,5kDa渗透液(LFPH-I)的IC50值为0.123mg·mL-1。采用凝胶层析对LFPH-I进一步分离,考察了各因素对凝胶层析的影响,得到最优条件：柱规格(1.6cm×45cm)、蒸馏水洗脱1.0mL·min-1、上样量为20mg。在此条件下,可将LFPH-I分成A. B、C、D、E五个组分,其中C组分(LFPH-I-C)活性最高,IC50为0.110mg·mL-1。考察了LFPH-I的抗胃肠道稳定性能,实验表明LFPH-I经胃蛋白酶消化后活性略有上升；经胰蛋白酶作用稳定性良好,但LFPH-I经胃蛋白酶作用后再用胰蛋白酶处理则活性有所下降。采用离子交换色谱-反相高效液相色谱法结合(IEC/RP-HPLC法)分离纯化LFPH-I-C,得到活性组分G3；同时研究了连续多步反相高效液相色谱法(RP-HPLC/RP-HPLC/RP-HPLC法)分离纯化LFPH-I-C,得到活性组分U73D。经反相高效液相色谱和高效毛细管电泳检测二者均为单一组分。通过飞行时间质谱鉴定了G3和U73D结构,解析其氨基酸序列分别为Arg-Val-Cys-Leu-Pro (RVCLP)和Ser-Pro-Arg-Cys-Arg (SPRCR),ICso值分别为175μM和41μM。固定化金属离子亲和分离技术(IMAC)在重组蛋白和重组多肽的分离纯化中己得到广泛应用。在采用IEC/RP-HPLC法及RP-HPLC/RP-HPLC/RP-HPLC法分离纯化LFPH-I-C得到长蛇鲻降血压肽结构基础上,探索了IMAC分离长蛇鲻降血压肽的方法。以反相悬浮法制备琼脂糖微球载体,确定了最佳制备工艺为琼脂糖浓度2.5%,乳化剂用量1.5%,乳化温度60℃,搅拌速度400rmin-1,此时获得的目标微球载体成球率为70.80%。以环氧氯丙烷为活化剂,确定了最佳活化条件为：NaOH溶液浓度为0.8mol·L-1,环氧氯丙烷体积分数为20%,NaBH4的浓度为3.0g.L-1,活化温度为40℃,活化时间为4h。以活化的琼脂糖微球为载体,亚氨基二乙酸(IDA)为连接臂,Cu2+、Ni2+、 Zn2+为螯合金属离子,分别制备了固定化AS-Cu2+、AS-Zn2+、AS-Ni2+三种亲和介质,其配基密度分别为32.05、33.22、29.17μmol·g-1。考察三种亲和介质在pH3.0-9.0的范围内金属离子的泄露百分率,结果表明酸性环境比碱性环境更容易让金属离子泄露,三种亲和介质中AS-Cu2+最稳定性,AS-Ni2+次之,AS-Zn2+最容易泄露。分别研究了三种亲和介质AS-Cu2+-、AS-Zn2+、AS-Ni2+对LFPH-I的吸附。以LFPH-I为原料,通过对比亲和介质分离ACEI的效果,筛选了AS-Ni2+作为长蛇鲻ACEI分离的亲和介质。其最优层析条件为：0.02mol·L-1磷酸缓冲盐(pH6.8,含1.0mol·L-1NaCl)为平衡液、0.02mol·L-1磷酸缓冲盐(pH4.0,含0.5mol·L-1NaCl)为洗脱液。经AS-Ni2+富集所得组分IC50值为0.116mg·mL-1.通过测定、分析粗蛋白LFPH-I及亲和层析富集组分的氨基酸摩尔百分比的变化,发现在实验条件下,相对其它氨基酸,AS-Ni2+对Met、His、 Tyr、Pro、Ile、Leu具有更高的富集作用。采用反相高效液相色谱对AS-Ni2+富集的组分进一步分离,得到活性组分N5,经反相高效液相色谱和高效毛细管电泳检测为单一组分。经飞行时间质谱测定、解析其氨基酸序列为Arg-Tyr-Arg-Pro (RYRP),其IC50值为52μM,具有较高的活性。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-14
第一章 绪论  14-34
  1.1 前言  14-15
  1.2 降血压肽的研究进展  15-19
    1.2.1 降血压肽作用机理及结构特征  15-17
    1.2.2 海洋生物降血压肽研究进展  17-19
  1.3 降血压肽的制备技术  19-20
    1.3.1 水解法制备降血压肽  19
    1.3.2 微生物发酵法制备降血压肽  19
    1.3.3 DNA重组技术制备降血压肽  19-20
    1.3.4 化学合成法制备降血压肽  20
    1.3.5 计算机辅助设计制备降血压肽  20
  1.4 降血压肽的分离纯化研究进展  20-32
    1.4.1 常规技术、方法分离纯化降血压肽  20-25
    1.4.2 亲和色谱分离纯化降血压肽  25-32
  1.5 本课题研究的目的、意义及主要内容  32-34
    1.5.1 本课题研究目的与意义  32-33
    1.5.2 主要内容  33-34
第二章 长蛇鲻酶解制备降血压肽工艺研究  34-49
  2.1 前言  34-35
  2.2 材料与仪器  35
    2.2.1 材料与试剂  35
    2.2.2 仪器设备  35
  2.3 实验方法  35-38
    2.3.1 分析方法  35-37
    2.3.2 蛋白酶筛选及酶解工艺研究  37-38
  2.4 结果与讨论  38-48
    2.4.1 原料蛋白含量测定及氨基酸组成分析  38-39
    2.4.2 蛋白质标准曲线  39
    2.4.3 马尿酸标准曲线  39-40
    2.4.4 蛋白酶筛选及酶解工艺优化  40-48
  2.5 本章小结  48-49
第三章 酶解物初步分离及其性能研究  49-63
  3.1 前言  49-50
  3.2 材料与仪器  50-51
    3.2.1 材料与试剂  50
    3.2.2 仪器设备  50-51
  3.3 实验方法  51-53
    3.3.1 长蛇鲻鱼肉蛋白酶解物(LFPH)制备  51
    3.3.2 蛋白质含量、ACE抑制活性的测定及蛋白回收率计算  51
    3.3.3 超滤分离降血压肽  51
    3.3.4 Sephadex G-15凝胶色谱分离降血压肽  51-52
    3.3.5 降血压肽的消化实验  52-53
  3.4 结果与讨论  53-62
    3.4.1 超滤分离降血肽  53-54
    3.4.2 凝胶色谱分离降血压肽  54-60
    3.4.3 消化酶对降血压肽稳定性的影响  60-62
  3.5 本章小结  62-63
第四章 长蛇鲻降血压肽分离纯化及结构鉴定  63-76
  4.1 前言  63-64
  4.2 材料与仪器  64-65
    4.2.1 材料与试剂  64-65
    4.2.2 仪器设备  65
  4.3 实验方法  65-68
    4.3.1 凝胶色谱C峰收集组分(LFPH-I-C)的制备  65
    4.3.2 降血压肽的ACE抑制活性测定  65
    4.3.3 离子交换色谱-反相高效液相色谱分离降血压肽  65-66
    4.3.4 连续多步反相高效液相色谱分离降血压肽  66-67
    4.3.5 MALDI-TOF-TOF测定氨基酸序列  67-68
  4.4 结果与讨论  68-75
    4.4.1 离子交换-反相高效液相色谱分离降血压肽  68-70
    4.4.2 连续多步反相高效液相色谱分离降血压肽  70-72
    4.4.3 长蛇鲻降血压肽的氨基酸序列测定  72-75
  4.5 本章小结  75-76
第五章 固定化金属离子亲和介质的制备工艺  76-90
  5.1 前言  76
  5.2 材料与仪器  76-77
    5.2.1 材料与试剂  76-77
    5.2.2 仪器设备  77
  5.3 实验方法  77-81
    5.3.1 琼脂糖微球(AS)的制备工艺研究  77-78
    5.3.2 琼脂糖微球的活化  78-79
    5.3.3 螯合基的连接与金属离子配基的螯合  79
    5.3.4 亲和介质金属离子配基密度测定  79-81
  5.4 结果与讨论  81-89
    5.4.1 琼脂糖微球工艺研究  81-84
    5.4.2 不同因素对琼脂糖环氧基修饰密度的影响  84-87
    5.4.3 金属离子亲和配基的连接  87
    5.4.4 亲和介质金属离子配基的测定  87-89
  5.5 本章小结  89-90
第六章 固定化金属离子亲和层析分离降血肽研究  90-109
  6.1 前言  90
  6.2 材料与仪器  90-91
    6.2.1 材料与试剂  90-91
    6.2.2 仪器设备  91
  6.3 实验方法  91-95
    6.3.1 金属离子泄露率测定  91-92
    6.3.2 金属离子亲和介质对LFPH-I的吸附研究  92-93
    6.3.3 金属离子配基的选择  93
    6.3.4 亲和层析分离降血压肽  93-94
    6.3.5 反相高效液相色谱分离降血压肽  94-95
    6.3.6 MALDI-TOF-TOF测定氨基酸序列  95
  6.4 结果与讨论  95-108
    6.4.1 不同pH条件下金属离子泄露率  95-97
    6.4.2 不同因素对亲和介质吸附LFPH-I的影响  97-100
    6.4.3 金属离子配基的选择  100-101
    6.4.4 亲和层析分离降血压肽  101-105
    6.4.5 反相高效液相色谱分离降血压肽结果  105-106
    6.4.6 长蛇鲻降血压肽的氨基酸序列测定  106-108
  6.5 本章小结  108-109
第七章 结论与展望  109-112
  7.1 主要结论  109-110
  7.2 创新点  110
  7.3 展望  110-112
参考文献  112-127
附录  127-128
致谢  128-129
博士期间发表论文和申请的专利  129

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 生物制品药物的生产
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