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梅花鹿胎盘寡肽制备、纯化工艺的研究

作　者: 曹晓宇
导　师: 皮钰珍
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 食品科学
关键词: 梅花鹿胎盘寡肽提取分离纯化
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

梅花鹿胎盘是传统名贵的中药材和高级营养品,研究发现鹿胎盘的蛋白含量高达70%以上,氨基酸含量丰富,种类齐全,配比合理,其中含有的寡肽类生物活性物质可以增强机体的免疫功能；调节机体内分泌,维持机体正常功能；延缓衰老、抗癌等功效。本研究以梅花鹿胎盘为原料,利用传统的反复冻融法结合超声波细胞破碎技术对梅花鹿胎盘进行提取,采用超滤法对梅花鹿胎盘中的活性寡肽进行分离,最后利用阴离子交换柱、凝胶层析柱结合反相高效液相色谱技术对梅花鹿胎盘寡肽进行纯化,并测定活性寡肽的分子量,分析其生物活性,主要结论如下：1.采用传统的反复冻融法与超声波细胞破碎法相结合技术对梅花鹿胎盘中的活性寡肽进行提取,考察了冻融次数、生理盐水加入倍数、超声波破碎次数四个因素对活性寡肽提取效果的影响。试验表明,提取的最佳工艺条件为：在-20℃下冷冻24h,室温下融化反复操作3次,加入4倍生理盐水,在200w功率下超声波破碎18s,重复操作5次,每次间隔25s。在此条件下获得的梅花鹿胎盘寡肽粗提物的浓度为247.85mg/ml。2.采用超滤法对梅花鹿胎盘中活性寡肽进行分离,考察了料液浓度、压力、温度、流速、浓缩倍数及操作时间等因素对分离效果的影响,确定最佳分离条件为：料液浓度1.5%,压力0.06MPa,温度30℃,流速2.0mL/s,浓缩倍数2.5倍,操作时间3min,分离过程中杂蛋白的去除率达到43.78%。膜污染后用0.2%NaOH浸泡2h,循环1h后,用HCl浸泡1h,循环0.5h,再用水洗至中性,流量恢复率值最大为0.834。3.采用DEAE52离子交换柱、Sephadex G-25凝胶层析柱对梅花鹿胎盘寡肽粗提物进行初步纯化,试验结果表明：梅花鹿胎盘寡肽粗提溶液利用DEAE52柱,用0.2mol/L的Nacl缓冲液洗脱得到2个组分,经E-玫瑰花环试验证实第一个组分生物活性较高,使脱受体的人体T淋巴细胞的E-玫瑰花环率恢复到52.5%。将分离出的较高活性组分经Sephadex G-25凝胶层析柱,用0.15mol/L的NaCl缓冲溶液洗脱,得到2个组分,经E-玫瑰花环实验证明,分离出的第二个组分具有较高的活性,使脱受体的人体T淋巴细胞的E-玫瑰花环率恢复到60%,其特征吸收峰在223nm处。4.利用反相高效液相色谱技术对梅花鹿胎盘寡肽进一步纯化,考察三氟乙酸(TFA)的加入量、有机相的起始浓度以及流速和温度对纯化效果的影响。最后确定最佳分离纯化条件为：色谱柱Hypersil ODS C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相A液0.10%TFA～乙睛,B液0.10%TFA～水,30min内10%A-50%A,90%B～50%B凸型梯度洗脱,流速0.2ml/min,温度30℃,其特征吸收峰在223nm。在此条件下分离获得三个组分,其中组分3的生物活性最强,能够使脱受体的人T淋巴细胞的玫瑰花环形成率恢复到72.5%。利用高效凝胶过滤色谱法测定其分子量约为0.385KDa。通过氨基酸分析仪测定活性寡肽中半胱氨酸、天冬氨酸、酪氨酸三种氨基酸的含量最高。

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摘要 10-12Abstract 12-14第一章绪论 14-24 1.1 梅花鹿胎盘简介 14-15 1.1.1 梅花鹿胎盘的成分 14 1.1.2 梅花鹿胎盘的生理功能 14-15 1.2 活性寡肽 15-18 1.2.1 活性寡肽的结构 15 1.2.2 活性寡肽的吸收机制及特点 15-16 1.2.3 活性寡肽的营养作用 16-18 1.3 活性寡肽的研究进展 18-22 1.3.1 活性寡肽的纯化方法 18-20 1.3.2 重要寡肽的研究进展 20-22 1.4 立题目的及意义 22-23 1.5 研究内容 23 1.6 技术路线 23-24第二章梅花鹿胎盘寡肽的提取 24-32 2.1 实验材料及方法 24-26 2.1.1 材料及试剂 24 2.1.2 主要仪器及设备 24 2.1.3 试验方法 24-26 2.2 结果与分析 26-30 2.2.1 冻融次数对蛋白提取率的影响 26-27 2.2.2 生理盐水倍数对蛋白提取率的影响 27-28 2.2.3 超声波细胞破碎次数对蛋白提取率的影响 28 2.2.4 梅花鹿胎盘提取工艺的正交试验及方差分析 28-30 2.2.5 梅花鹿胎盘寡肽蛋白含量及氨基酸组成分析 30 2.3 讨论 30-31 2.4 结论 31-32第三章超滤法分离梅花鹿胎盘寡肽的研究 32-39 3.1 实验材料及方法 32-33 3.1.1 材料及试剂 32 3.1.2 主要仪器及设备 32 3.1.3 试验方法 32-33 3.2 结果与分析 33-37 3.2.1 料液浓度对超滤效果的影响 33-34 3.2.2 压力对超滤效果的影响 34 3.2.3 温度对超滤效果的影响 34-35 3.2.4 流速对超滤效果的影响 35 3.2.5 浓缩倍数对超滤效果的影响 35-36 3.2.6 操作时间对超滤效果的影响 36 3.2.7 蛋白含量的测定 36 3.2.8 膜的污染及其清洗 36-37 3.3 讨论 37-38 3.4 结论 38-39第四章层析法纯化梅花鹿胎盘寡肽的研究 39-53 4.1 试验材料与方法 39-43 4.1.1 材料与试剂 39 4.1.2 主要仪器 39 4.1.3 试验方法 39-43 4.2 结果与分析 43-51 4.2.1 离子交换柱的选择 43-44 4.2.2 DEAE52离子交换柱对梅花鹿胎盘寡肽的分离效果 44-46 4.2.3 Sephadex G-25凝胶层析柱对活性寡肽的分离效果 46-51 4.3 讨论 51-52 4.3.1 离子交换柱层析的讨论 51 4.3.2 凝胶柱层析的讨论 51-52 4.4 结论 52-53第五章利用反相液相色谱纯化梅花鹿胎盘寡肽的研究 53-69 5.1 试验材料与方法 53-55 5.1.1 材料与试剂 53 5.1.2 主要试验仪器 53 5.1.3 试验方法 53-55 5.2 结果与分析 55-67 5.2.1 不同TFA的浓度对分离效果的影响 55-57 5.2.2 有机相对分离效果的影响 57-60 5.2.3 流速对分离效果的影响 60-62 5.2.4 温度对分离效果的影响 62-64 5.2.5 各组分蛋白质含量的测定 64-65 5.2.6 样品生物活性的比较 65 5.2.7 高效凝胶过滤色谱法对寡肽分子量的测定 65-66 5.2.8 氨基酸的测定及活性分析 66 5.2.9 各步骤分离获得样品的纯度及活性比较 66-67 5.3 讨论 67-68 5.4 结论 68-69参考文献 69-72致谢 72-73攻读学位论文期间发表文章 73

梅花鹿胎盘寡肽制备、纯化工艺的研究

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