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类黄酮调控基因AtMYB12的异源表达及其对植物抗病性的贡献

作　者: 李明
导　师: 储昭辉
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 类黄酮 AtMYB12 HPLC 芦丁抗病反应
分类号: S432.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

生物类黄酮（bioflavonoids）是自然界存在的一大类酚类物质次生代谢产物，在自然界中广泛存在并具有抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防心血管疾病、防癌等作用。当前满足市场需求的途径主要通过依赖化学方法从天然材料如银杏叶、洋葱、柠檬、各种中药材等中提取。本研究利用番茄果实特异性表达启动子E4、PG、2A12驱动拟南芥中生物类黄酮的特异性调控因子AtMYB12基因在番茄中表达，获得一系列富含类黄酮（芦丁、山奈酚芸香糖苷和柚皮素查尔酮）的番茄转基因株系，进一步验证了拟南芥中生物类黄酮的特异性调控因子AtMYB12基因的功能，比较了不同启动子驱动AtMYB12基因调控类黄酮累积的差异，为进一步利用番茄作为生物反应器生产类黄酮组分物质提供参考。首先，本研究利用不同果实特异性启动子驱动AtMYB12基因转化番茄品种并研究了其调控合成类黄酮类物质的能力。采用pX6-GFP载体、高保真PCR技术，通过分步克隆策略，分别构建了植物表达载体pX6-E4::AtMYB12、pX6-PG::AtMYB12和pX6-2A12::AtMYB12，并导入农杆菌工程菌株AGL1。通过叶盘法转化番茄品种圣女果或俏美人，分别获得阳性转基因植株。高压液相色谱（HPLC）法检测转基因番茄果实材料，结果显示三个载体pX6-E4::AtMYB12、pX6-PG::AtMYB12和pX6-2A12::AtMYB12的转基因果实果皮中均可检测到类黄酮类物质的提高，其中柚皮素查尔酮在转基因果皮中含量显著提高。三个不同启动子能够导致基因表达量和转基因番茄果实中物质的含量不同，E4启动子能够调控AtMYB12基因在果肉中高效表达，并引起下游参与类黄酮合成基因的上调表达，PG和2A12启动子能够调控AtMYB12基因在果皮中表达，同时引起下游参与类黄酮合成基因的上调表达。其次，利用烟草遗传转化系统研究了其它预测类黄酮或咖啡酰奎尼酸合成相关基因的功能。将AtMYB12基因的同源基因AtMYB11在转入三生烟草后也起到与AtMYB12基因相同的效果，提高了转基因烟草植株中类黄酮类物质的含量，但是也同样没有激活下游次生代谢产物咖啡酰奎尼酸的合成。转基因烟草植株中，单独超量表达NtHCT、NtHQT、NtC3H均没有引起下游次生代谢产物咖啡酰奎尼酸的合成，但是NtHQT基因的超量表达后的HPLC结果显示转基因烟草中芦丁的含量有所下降，推测可能由于新的未知物质的合成而阻碍或降低了芦丁的合成。进而分析了类黄酮累积的烟草转基因株系的抗病性状，发现转AtMYB12基因的烟草植株中由于芦丁含量的提高而导致转基因烟草植株对烟草青枯病菌、烟草炭疽病菌、烟草赤星病菌的抗性提高，但转基因植株对供试PVY病毒株系表现更加敏感。转基因烟草植株的抗病反应提高，主要是由于转基因烟草在接种病原后抗病相关基因的迅速高效表达，从而引起植株对多种病害的抗性。而且转基因烟草提取物的平板抑菌试验也进一步证实了芦丁等类黄酮物质对细菌和真菌生长具有一定的抑制效果。转基因的番茄果实由于芦丁含量的提高也对番茄灰霉病表现抗性，同时芦丁的平板抑菌试验进一步证实了芦丁对番茄灰霉病的抗性效果。生物类黄酮作为植物的一大类次生代谢产物的总称，不仅是植物生长和防御反应中所必须的，同时也对人体有非常显著且良好的效果，我们通过栽培型小果番茄和重要经济作物烟草作为生物反应器生产类黄酮生物制品，得到具有无选择标记的番茄新品种和高含类黄酮和咖啡酰奎尼酸的烟草新品种，为进行品种培育和产业化加工奠定基础。同时芦丁作为一种植物的次生代谢产物，可以作为烟草植株抗病反应的激发子，诱导调控烟草植株对多种病害的抗性，为培育高产优质抗病的烟草新品种奠定了基础。同时，也为结合类黄酮的生物发酵生产和与其它杀菌剂成份混合调制生产生物源农药提供思路。

全文目录

中文摘要  11-13
ABSTRACT  13-15
第一章文献综述  15-43
  引言  15
  1.生物类黄酮的结构及功能分析  15-32
    1.1 生物类黄酮的结构及分布  15-17
    1.2 类黄酮的生理功能  17-24
      1.2.1 生物类黄酮的药用功效  17-20
        1.2.1.1 类黄酮具有清除自由基、抗氧化作用  17-18
        1.2.1.2 类黄酮具有抗血栓、保护心脑血管作用  18
        1.2.1.3 类黄酮具有抗癌抗肿瘤作用  18-19
        1.2.1.4 类黄酮具有消炎镇痛功效  19
        1.2.1.5 类黄酮具有调节免疫力的作用  19-20
        1.2.1.6 类黄酮的其他药用功效  20
      1.2.2 生物类黄酮的生理作用  20-24
        1.2.2.1 类黄酮可以作为信号分子  20-21
        1.2.2.2 类黄酮与植物的防御反应相关  21-24
    1.3 类黄酮的合成代谢途径  24-29
      1.3.1 基因调控引起类黄酮的积累  24-25
      1.3.2 能量代谢过程中类黄酮的合成  25-27
      1.3.3 在植物生长与防御相关的代谢中的物质交换  27-28
      1.3.4 UV 辐射引起类黄酮的积累  28-29
    1.4 类黄酮中的重要组分芦丁  29-30
    1.5 类黄酮中的重要组分槲皮素  30-31
    1.6 类黄酮中的重要组分咖啡酰奎尼酸  31-32
  2.类黄酮的特异性调控因子 AtMyb12 的研究进展  32-35
  3. 果实中的特异性启动子（E4, 2A12, PG）的研究进展  35-38
    3.1 番茄果实特异性启动子 E4  35-36
    3.2 番茄果实特异性启动子 2A12  36
    3.3 番茄果实特异性启动子 PG  36-37
    3.4 番茄果实特异性启动子的应用  37-38
  4.生物反应器的研究进展  38-40
    4.1 番茄作为生物反应器的研究进展  39-40
    4.2 烟草作为生物反应器的研究进展  40
  5.激发子诱导植物防御反应  40-42
    5.1 植物激发子（内源激发子）的种类  41-42
    5.2 激发子引起的信号传导  42
  6.本研究的目的和意义  42-43
第二章高含类黄酮转基因植株的培育  43-86
  1.材料与方法  43-56
    1.1 材料  43-45
      1.1.1 供试植物材料  43
      1.1.2 菌株和载体  43
      1.1.3 常用酶与生化试剂  43
      1.1.4 常用仪器  43
      1.1.5 溶液及培养基的配制  43-45
    1.2 实验方法  45-56
      1.2.1 PCR 引物设计  45-47
      1.2.2 总 RNA 的抽提  47-48
      1.2.3 RT-PCR  48
      1.2.4 目的基因的克隆  48-49
      1.2.5 目的片段与质粒 DNA 的酶切  49
      1.2.6 载体去磷酸化  49-50
      1.2.7 植物表达载体的构建  50-51
      1.2.8 序列测定  51
      1.2.9 感受态细胞的制备  51
      1.2.10 热激转化大肠杆菌（DH5α）  51-52
      1.2.11 电转化农杆菌感受态细胞（AGL I 或 LBA4404）  52
      1.2.12 转化菌落的阳性鉴定  52
      1.2.13 质粒 DNA 的提取  52-53
      1.2.14 重组质粒的酶切鉴定  53
      1.2.15 农杆菌介导的番茄遗传转化  53
      1.2.16 农杆菌介导的烟草遗传转化  53-54
      1.2.17 植物总 DNA 的提取  54
      1.2.18 转基因植株的阳性检测  54
      1.2.19 样品制备、转基因烟草和番茄中类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量测定  54-55
      1.2.20 转基因植株的基因表达量鉴定（qRT-PCR）  55-56
  2.结果与分析  56-82
    2.1 AtMYB12 基因植物表达载体的构建  56-62
      2.1.1 拟南芥 AtMYB12 基因 cDNA 的克隆  56-57
      2.1.2 果实特异性启动子 PG、2A12、E4 的克隆  57-58
      2.1.3 过渡载体 pX6-PG、pX6-2A12 和 pX6-E4 的构建  58-59
      2.1.4 番茄表达载体的构建  59-61
      2.1.5 番茄表达载体转化农杆菌（AGL1）  61-62
    2.2 农杆菌介导的番茄遗传转化  62-65
    2.3 番茄果实类黄酮和咖啡酰奎尼酸含量 HPLC 分析  65-70
    2.4 烟草表达载体的构建  70-77
      2.4.1 烟草表达载体 pBin19::AtMYB11 的构建  70-71
      2.4.2 烟草表达载体的构建  71-74
      2.4.3 烟草表达载体转化农杆菌（LBA4404）  74-77
    2.5 农杆菌介导的烟草遗传转化  77-80
    2.6 烟草类黄酮含量 HPLC 分析  80-82
  3 讨论  82-85
    3.1 拟南芥转录因子 AtMYB12 基因和 AtMYB11 基因参与调控类黄酮类物质的合成  82-83
    3.2 E4、PG、2A12 调控 AtMYB12 基因表达的能力弱于 E8 启动子  83-84
    3.3 AtMYB12 基因弱的上调表达未激活类黄酮合成下游基因的表达，而只引起柚皮素查尔酮的富集  84
    3.4 烟草中单独超量表达与咖啡酰奎尼酸合成相关的基因没有提高咖啡酰奎尼酸的含量  84-85
  4 结论  85-86
第三章转基因烟草对病害的抗性分析  86-110
  1.材料与方法  86-90
    1.1 材料  86-87
      1.1.1 供试植物材料  86
      1.1.2 供试病原菌  86
      1.1.3 病原菌的培养和保存  86-87
      1.1.4 生化试剂  87
      1.1.5 常用仪器  87
      1.1.6 培养基的配制  87
    1.2 实验方法  87-90
      1.2.1 烟草次生代谢物的提取  87
      1.2.2 平板抑菌试验  87-88
      1.2.3 病原菌接种  88-89
      1.2.4 烟草总 RNA 的抽提  89
      1.2.5 RT-PCR  89
      1.2.6 抗病相关基因表达量测定（qRT-PCR）  89
      1.2.7 活性氧检测  89
      1.2.8 过氧化氢检测  89
      1.2.9 NO 检测  89-90
      1.2.10 接菌后叶片中孢子形态观察  90
  2 结果与分析  90-106
    2.1 转基因烟草对多种病虫害提高了抗性  90-102
      2.1.1 转基因烟草中类黄酮类物质的测定  90
      2.1.2 转基因烟草抗虫效果检测  90-92
      2.1.3 转基因烟草对细菌病害的敏感性  92-98
      2.1.4 转基因烟草对真菌病害的敏感性  98-100
      2.1.5 转基因烟草对马铃薯 Y 病毒（PVY）的敏感性  100-102
      2.1.6 转基因番茄对番茄灰霉病的敏感性  102
    2.2 烟草提取物对病原菌生长的影响  102-106
      2.2.1 烟草提取物对山东青枯病菌生长的影响  102-103
      2.2.2 烟草提取物对真菌生长的影响  103-106
  3.讨论  106-109
    3.1 AtMYB12 基因能够调控转基因烟草中芦丁的合成和积累  106-107
    3.2 芦丁含量提高的转基因烟草对多种病害表现抗性  107
    3.3 转基因烟草激发的抗病反应机制  107-108
    3.4 芦丁作为激发子诱导植物抗病性  108-109
  4.结论  109-110
参考文献  110-128
致谢  128-129
附录Ⅰ  129-131
附录Ⅱ  131-133
附录Ⅲ  133-136
附件  136

类黄酮调控基因AtMYB12的异源表达及其对植物抗病性的贡献

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