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乙肝病毒表面抗原在衣藻叶绿体中高效表达的研究

作　者: 于洋
导　师: 苏忠亮
学　校: 青岛科技大学
专　业: 药物化学
关键词: 莱茵衣藻乙肝疫苗 Elisa 乙肝病毒表面抗原基因PreS2S
分类号: R373.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

衣藻因其所具有的独特细胞结构,清晰的遗传学背景,是研究各种生命现象的模式生物。衣藻叶绿体是良好的生物反应器,是表达外源基因的理想场所。利用转基因衣藻可以表达出具有该附加值的药用蛋白质,.但是目前存在外源基因表达量不高的问题限制了衣藻的商业化应用。乙肝病毒是一种严重威胁着人类的健康的病菌。接种乙肝疫苗对预防乙肝病毒感染,控制乙肝病毒传播具有重要意义。我国是乙肝大国,根据我国国情,需要生产足量、显效、廉价的疫苗。随着基因工程和分子生物学的发展,已经有了在衣藻中表达药用蛋白的先例。本研究是基于以上背景,在实验室原有质粒基础上继续构建含有乙肝病毒表面抗原PreS2_S基因的衣藻叶绿体表达载体,并将载体转入衣藻中使其表达乙肝病毒抗原蛋白HBsAg,经过抗性筛选得到阳性藻株,并通过Elisa检测法证实了PreS2S基因在衣藻叶绿体中获得了表达。本实验结果为以后利用衣藻叶绿体生物反应器生产乙肝疫苗奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-12
第一章文献综述  12-25
  1.1 莱茵衣藻简介及其基因工程研究进展  12-17
    1.1.1 莱茵衣藻的遗传特点  12-13
    1.1.2 莱茵衣藻叶绿体基因组特点及外源基因在叶绿体中的表达  13-14
    1.1.3 衣藻叶绿体基因组转化的原理  14
    1.1.4 外源基因导入莱茵衣藻叶绿体的方法  14-15
      1.1.4.1 基因枪转化法  14-15
      1.1.4.2 玻璃珠转化法  15
      1.1.4.3 电击转化法  15
      1.1.4.4 显微注射法  15
      1.1.4.5 其他转化方法  15
    1.1.5 关于衣藻叶绿体启动子  15-16
      1.1.5.1 rbcL启动子  16
      1.1.5.2 atpA启动子  16
      1.1.5.3 psbA启动子  16
      1.1.5.4 psbD启动子  16
    1.1.6 衣藻叶绿体转化的筛选标记  16-17
  1.2 衣藻其他领域的研究进展  17-20
    1.2.1 微藻生产生物柴油  17
    1.2.2 衣藻产氢的研究  17-18
    1.2.3 衣藻对污水净化的研究  18-19
    1.2.4 衣藻基因工程方法表达药用蛋白  19
    1.2.5 衣藻叶绿体表达蛋白的优点  19-20
    1.2.6 外源基因在衣藻细胞核中基因表达存在的问题  20
  1.3 关于乙肝疫苗及其研究进展  20-23
    1.3.1 乙肝病毒表面抗原作用原理  21-22
    1.3.2 乙肝病毒基因组  22
    1.3.3 基因工程乙肝疫苗研究进展  22-23
  1.4 本实验研究的目的和意义  23-25
第二章 Pre-S_2_S的克隆  25-35
  2.1 实验仪器设备与材料  25-35
    2.1.1 仪器与主要设备  25
    2.1.2 菌株和DNA片段  25-26
    2.1.3 工具酶及试剂  26
    2.1.4 主要试剂的配制方法  26-27
    2.1.5 实验方法  27-32
      2.1.5.1 PCR扩增目的序列  27
      2.1.5.2 DNA琼脂糖凝胶电泳检测  27-28
      2.1.5.3 PCR产物回收  28-29
      2.1.5.4 TA克隆  29
      2.1.5.5 制备感受态细胞  29-30
      2.1.5.6 转化  30
      2.1.5.7 氨苄青霉素抗性筛选  30
      2.1.5.8 PCR鉴定阳性菌落  30
      2.1.5.9 大肠杆菌质粒提取  30-32
      2.1.5.10 双酶切鉴定阳性菌落质粒  32
      2.1.5.11 测序鉴定  32
      2.1.5.12 保存甘油种  32
    2.1.6 结果与分析  32-35
      2.1.6.1 PreS_2_S基因的PCR扩增结果  32-33
      2.1.6.2 PCR和双酶切鉴定阳性菌落  33-34
      2.1.6.3 测序结果  34-35
第三章含PreS_2_S基因中间表达载体的构建  35-52
  3.1 质粒psk-atpA-S的构建  35-37
    3.1.1 psk质粒图谱  35
    3.1.2 实验方法  35
    3.1.3 预期构建质粒图谱  35-36
    3.1.4 结果与分析  36-37
      3.1.4.1 psk-atpA-S PCR鉴定  36
      3.1.4.2 psk-atpA-S双酶切鉴定  36-37
  3.2 含增强子的中间载体psk-atpA(dA)-S,psk-atpA(dAG)-S,psk-atpA(A+E)-S,psk-atpA(AG+E)-S的构建  37-41
    3.2.1 实验方法  37
    3.2.2 预期构建质粒图谱  37-39
    3.2.3 结果与分析  39-41
  3.3 含有筛选标记aadA基因的psk-atpA-S-aadA中间载体的构建  41-46
    3.3.1 实验材料  41-42
    3.3.2 实验方法  42-43
      3.3.2.1 酶切质粒  42
      3.3.2.2 突出末端的补平  42-43
      3.3.2.3 单酶切质粒  43
      3.3.2.4 质粒的构建  43
    3.3.3 结果与分析  43-46
      3.3.3.0 双酶切质粒p64D  43-44
      3.3.3.1 Not Ⅰ单酶切质粒psk-atpA-S  44-45
      3.3.3.2 Sac Ⅰ单酶切补平后DNA片段  45
      3.3.3.3 PCR鉴定阳性菌落  45-46
      3.3.3.4 双酶切鉴定质粒psk-atpA-S-aadA  46
  3.4 含有增强子元件及筛选标记aadA基因的中间载体的构建  46-50
    3.4.1 实验方法  46-47
    3.4.2 结果与分析  47-50
      3.4.2.1 Not Ⅰ单酶切  47
      3.4.2.2 Sac Ⅰ单酶切补平后DNA片段  47-48
      3.4.2.3 PCR鉴定阳性菌落  48-49
      3.4.2.4 双酶切鉴定  49-50
  3.5 本章小结  50-52
第四章含PreS_2_S基因的衣藻叶绿体表达载体的构建  52-57
  4.1 p64E-S表达载体的构建  52-53
    4.1.1 实验方法  52
    4.1.2 预期构建的质粒图谱  52
    4.1.3 结果与分析  52-53
  4.2 构建表达载体p64A-S,p64AG-S,p64AE-S,p64AGE-S  53-55
    4.2.1 实验方法  53-54
    4.2.2 预期构建的质粒图谱  54
    4.2.3 结果与分析  54-55
  4.3 本章小结  55-57
第五章 PreS_2_S基因在衣藻叶绿体中的表达  57-63
  5.1 实验方法  57-61
    5.1.1 实验材料  57
    5.1.2 衣藻培养基  57-58
    5.1.3 衣藻的培养  58
    5.1.4 转化  58-60
      5.1.4.1 准备衣藻细胞  58
      5.1.4.2 碱裂解法大量提取质粒  58
      5.1.4.3 质粒DNA的纯化  58-59
      5.1.4.4 微粒子弹的制备  59
      5.1.4.5 衣藻的转化方法  59-60
      5.1.4.6 过渡培养  60
      5.1.4.7 筛选培养  60
      5.1.4.8 转基因藻的表征分析  60
      5.1.4.9 阳性转基因藻株PCR验证  60
      5.1.4.10 阳性转基因藻株ELISA检测  60
    5.1.5 酶联免疫法(ELISA)检测  60-61
      5.1.5.1 主要试剂的配制方法  60
      5.1.5.2 实验方法  60
      5.1.5.3 新鲜样品中提取蛋白  60
      5.1.5.4 酶联免疫法(ELISA)检测乙肝抗原表达量  60-61
  5.2 结果与分析  61-62
    5.2.1 转基因藻的表征分析  61
    5.2.2 转基因藻株PCR验证  61-62
    5.2.3 转基因阳性藻株PCR验证  62
  5.3 本章小结  62-63
结论与展望  63-64
参考文献  64-68
致谢  68-69
攻读学位期间发表的学术论文目录  69-70

乙肝病毒表面抗原在衣藻叶绿体中高效表达的研究

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