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棘霉素中喹喔啉环的生物合成途径研究

作　者: 张晨
导　师: 周秀芬
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物学
关键词: 棘霉素喹喔啉环生物合成基因簇 NRP 类MbtH蛋白细胞色素P450 色氨酸2,3-双加氧酶
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

棘霉素(echinomycin)是具有良好的抗肿瘤活性的非核糖体肽(NRP)类的天然产物，其结构除了有非核糖体肽合酶（NRPS）合成的环肽骨架外，还具有两个喹喔啉环生色团。棘霉素正是通过这两个扁平状的喹喔啉环插入到DNA分子的碱基对之间，从而抑制了DNA的复制和转录。正是因为这个性质，该化合物作为抗肿瘤药物而被开发。棘霉素对DNA的结合具有一定的偏好性，其插入热点通常是侧翼为AT碱基对，中间为5′-CG-3′的序列，这是由棘霉素的环肽骨架中的氨基酸残基与DNA中的碱基通过非共价键进行特异的相互作用所决定的。同位素喂养实验发现其中的喹喔啉环的生物合成是以L-色氨酸为前体，此外还确定了(2S，3S) β-羟基色氨酸和β-羟基犬尿氨酸两个中间产物。但具体的生物合成途径一直都在研究和论证中。本课题出发菌株是由广东省农科院筛选的灰色变异链霉菌万隆亚种，它是通过太空诱变育种得到的突变株，也是拥有我国自主知识产权的微生物资源。利用棘霉素产生菌S. lasaliensis和S. triostinicus中的棘霉素生物合成基因簇中的喹喔啉-2-甲酸(QXC)腺苷酰化酶基因ecm1和trsA为探针，从构建的灰色变异链霉菌万隆亚种Streptomycesgriseovariabilis subsp. bandungensis subsp. nov基因组文库中筛选到2个阳性fosmidA111和K311。通过构建亚克隆和序列分析，发现K311含有所有A311中包含的棘霉素生物合成的相关基因。灰色变异链霉菌万隆亚种中棘霉素生物合成基因簇与S. triostinicus的棘霉素生物合成基因簇具有较高同源性，并且具有相同基因排布。与S. lasaliensis棘霉素生物合成基因簇相比，具有较低同源性和完全不同的基因排布。结合生物信息学分析，预测出灰色变异链霉菌万隆亚种中含有18个基因的棘霉素生物合成基因簇，包括3个与NRP骨架合成相关基因qui6、qui7、qui16，7个与喹喔啉环生物合成相关基因qui3、qui12、qui13、qui14、qui15、qui17、qui18，2个NRP骨架后修饰基因qui8、qui11，3个抗性基因qui1、qui2、qui10，1个调控基因qui4和2个未知功能基因qui5、qui9。在此基础上通过对关键基因的功能研究，解析了棘霉素芳香族结构单元喹喔啉环的生物合成途径。根据Kenji Watanabe的假说，喹喔啉环的生物合成在最初的阶段经历了从L-色氨酸直至N-甲酰-β-羟基犬尿氨酸的转化。然而，该假说完全基于氘标记的(2S,3S) β-羟基色氨酸和(2S,3R)β-羟基犬尿氨酸喂养实验，因此有必要对催化上诉几步反应的酶分别进行体外研究来检验特定的底物是否能产生预期的产物。最终，我们对类MbtH蛋白Qui5、双结构域NRPS蛋白Qui18、依赖于细胞色素P450的羟化酶Qui15和色氨酸2，3-双加氧酶Qui17的体外功能验证肯定了上述步骤，并揭示了其中每个酶生化功能。首先，在对双结构域NRPS蛋白Qui18的研究中，我们发现类MbtH蛋白Qui5对Qui18的辅助作用是L-色氨酸加载到Qui18的PCP结构域上所必需的。起初，我们发现单独表达的Qui18溶解性很差，当我们构建了一个pET28-a的衍生型表达载体pCT28，并用它把qui5和qui18串联在一起，这样共表达出来的Qui18溶解性提高了近100倍，对这个共表达产物进行分子筛分析发现，两个Qui5和两个Qui18形成四聚体，并且只有用共表达的蛋白，才能检测到L-色氨酸的加载。用单独表达的Qui18，或是在单独表达的Qui18中补加Qui5都不能检测到色氨酸的加载。其次，确定了加载的L-色氨酸能被依赖于细胞色素P450的羟化酶Qui15羟化，而该酶对游离的L-色氨酸不起作用。在对依赖于细胞色素P450的羟化酶Qui15研究中发现，它只能催化加载到Qui18上的色氨酸，使其β碳加上羟基。而对游离的L-色氨酸不起作用。最后，通过体外酶催化分析，确定了色氨酸双加氧酶Qui17能催化（2S,3S）β-羟基色氨酸，生成N-甲酰-β-羟基犬尿氨酸。由于Qui15所催化的羟化反应生成的产物量有限，并且还需要进行水解才能将β-羟基色氨酸释放出来，因此如此少量的β-羟基色氨酸很难满足研究色氨酸2，3-双加氧酶Qui17对底物的需求。于是，为了在体外研究Qui17，我们按照Kenji Watanabe的方法，用化学手段合成了(2S,3S) β-羟基色氨酸。我们发现Qui17与一般的色氨酸双加氧酶不同，一般的色氨酸双加氧酶只能催化L-色氨酸和5-氟色氨酸，而Qui17确实可以催化(2S,3S) β-羟基色氨酸，生成N-甲酰-β-羟基犬尿氨酸。对Qui17的空间结构进行了同源建模，尝试性分析了与羟基色氨酸的羟基有特异结合的氨基酸残基情况。通过以上喹喔啉环生物合成的前几步反应的验证，灰色变异链霉菌万隆亚种中棘霉素生物合成途径逐渐明确，但接下来的反应直至喹喔啉环的生成仍然是个不确定的谜，这也是我们将要进行的工作。既然喹喔啉环对棘霉素的活性有着至关重要的作用，研究喹喔啉环的生物合成途径会为通过组合生物合成手段进行醌霉素类天然产物结构改造，获得更有效的醌霉素类似物做出贡献。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
目录  13-16
符号说明  16-18
第一章文献综述  18-56
  1.1 非核糖体肽类天然产物的生物合成研究及应用概况  18-22
  1.2 NRPS 的功能单元解析  22-31
    1.2.1 NRPS 的组织结构  22-23
    1.2.2 腺苷酰化结构域 A-domain  23-24
    1.2.3 肽基载体蛋白 PCP-domain  24-25
    1.2.4 缩合结构域 C-domain  25-26
    1.2.5 硫酯酶结构域 Thioesterase domain  26-28
    1.2.6 非核糖体肽合酶的四级结构  28-29
    1.2.7 裁剪结构域  29
    1.2.8 4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶和 II 型硫酯酶  29-31
  1.3 醌霉素 quinomycin 类的天然产物生物合成研究  31-56
    1.3.1 醌霉素中的代表性化合物的结构比较  31-32
    1.3.2 醌霉素生物合成基因簇的确定  32-35
    1.3.3 醌霉素生物合成基因簇中的结构基因的功能研究  35-54
    1.3.4 本课题的研究意义  54-56
第二章实验材料和方法  56-76
  2.1 实验材料  56-63
    2.1.1 本课题涉及的菌株 (见表 2.1)  56-57
    2.1.2 本课题涉及的质粒(见表 2.2)  57-58
    2.1.3 本课题涉及的引物(见表 2.3)  58-59
    2.1.4 本课题涉及的培养基  59-60
    2.1.5 本课题涉及的试剂  60-63
  2.2 实验方法  63-76
    2.2.1 菌种的培养和保藏  63-64
    2.2.2 大肠杆菌中质粒的提取  64
    2.2.3 大肠杆菌和链霉菌质粒少量快速提取和检测  64
    2.2.4 链霉菌质粒的大量提取  64-65
    2.2.5 链霉菌总 DNA 的快速少量提取  65
    2.2.6 用于构建基因组文库的链霉菌总 DNA 提取  65
    2.2.7 凝胶中 DNA 片段的回收（Omega 公司试剂盒）  65-66
    2.2.8 溶液体系中 DNA 片段的沉淀  66
    2.2.9 DNA 片段酶切、酶连及末端去磷酸化  66
    2.2.10 PCR 扩增  66
    2.2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备  66-67
    2.2.12 质粒 DNA 对大肠杆菌感受态细胞的转化  67
    2.2.13 高压电穿孔法转化大肠杆菌  67
    2.2.14 构建基因组文库（CopyControl Fosmid Library Production Kit）  67-68
    2.2.15 PCR-Targeting 策略敲除基因  68
    2.2.16 基因中断菌株的筛选和验证  68-69
    2.2.17 融合蛋白的表达纯化  69-70
    2.2.18 多个融合蛋白的共表达  70-71
    2.2.19 SDS-垂直板凝胶电泳（SDS-PAGE）  71
    2.2.20 蛋白浓度测定  71
    2.2.21 棘霉素的生物学活性测定  71-72
    2.2.22 棘霉素的发酵  72
    2.2.23 棘霉素的大量提取  72
    2.2.24 利用 LC-MS 对棘霉素进行检测分析  72-73
    2.2.25 酶的体外活性检测  73-74
    2.2.26 生物信息学分析  74
    2.2.27 TDO 家族成员的系统进化树分析  74
    2.2.28 酶动力学米氏双曲线的拟合和动力学参数测定  74-75
    2.2.29 蛋白三维结构同源建模  75-76
第三章 S. griseovariabilis subsp. bandungensis subsp. Nov 棘霉素的生物合成基因簇的克隆与生物合成途径推测  76-87
  3.1 前言  76
  3.2 灰色变异链霉菌万隆亚种基因组文库的构建  76-77
  3.3 棘霉素生物合成基因簇的克隆  77-83
  3.4 棘霉素生物合成机制  83-86
  3.5 本章小结  86-87
第四章 QXC 生物合成起始氨基酸加载的研究  87-110
  4.1 前言  87-88
  4.2 NRPS 蛋白 Qui18 的氨基酸序列分析  88-91
    4.2.1 Qui18 的 A-domain 氨基酸序列分析  88-91
    4.2.2 Qui18 的 PCP-domain 氨基酸序列分析  91
  4.3 类 MbtH 蛋白 Qui5 的序列分析  91-92
  4.4 Qui5 和 Qui18 的 pET-28a（+）表达克隆的构建  92-93
  4.5 Qui18 胰蛋白酶水解肽段的 Q-TOF 检测  93-98
  4.6 共表达载体 pCT28 的构建及 Qui5 和 Qui18 共表达克隆的构建  98-102
  4.7 Qui5 和 Qui18 的共表达  102-104
  4.8 Qui18 的 Q-TOF 检测  104-105
  4.9 Qui18 的体外活性检测  105-108
  4.10 本章小结  108-110
第五章 L-色氨酸的β-羟化  110-115
  5.1 前言  110
  5.2 Qui15 的表达克隆的构建  110-111
  5.3 Qui15 的纯化  111-112
  5.4 Qui15 的体外活性检测  112-114
  5.5 本章小结  114-115
第六章棘霉素生物合成基因簇中的色氨酸 2，3-双加氧酶  115-135
  6.1 前言  115-116
  6.2 TDO 家族的进化树分析  116-118
  6.3 qui17 的敲除突变株 ZC1 的构建和发酵  118-121
  6.4 Qui17 的表达纯化  121-122
  6.5 （2S,3S）β-羟基色氨酸的化学合成  122-124
  6.6 以（2S,3S）β-羟基色氨酸为底物的 Qui17 的体外活性检测  124-126
  6.7 以 L-色氨酸为底物的 Qui17 的体外活性检测  126-128
  6.8 以 L-色氨酸为底物的 Qui17 的动力学全波长扫描和参数测定  128-129
  6.9 以 L-色氨酸为底物的 Qui17 的动力学全波长扫描和参数测定  129-131
  6.10 Qui17 单体的三维结构同源建模  131-133
  6.11 本章小结  133-135
第七章总结与展望  135-138
  7.1 本研究工作总结及主要创新点  135-136
  7.2 本研究工作展望  136-138
参考文献  138-145
攻读学位期间发表或已录用的学术论文  145-146
致谢  146-150
附件  150

棘霉素中喹喔啉环的生物合成途径研究

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