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锌指蛋白KRAB结构域入核及ZNF300在K562细胞诱导分化中的功能探索

作　者: 蔡锦阳
导　师: 李文鑫
学　校: 武汉大学
专　业: 微生物学
关键词: ZNF268 ZNF300 KRAB 亚细胞定位 诱导分化
分类号: Q51
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


锌指蛋白作为主要的转录调控因子,在RNA的转录过程中发挥着非常重要的调控作用。根据不同的分类方法,锌指蛋白可以分为许多不同的种类,其中有一类锌指蛋白在其N端含有非常保守的KRAB结构域,称之为KRAB型锌指蛋白,这类锌指蛋白大约占总锌指蛋白转录因子的40%。由此可见KRAB型锌指蛋白在生命活动中发挥着非常重要的作用,但是对其具体功能我们还知之甚少。本实验室从早期人胚胎的cDNA文库中筛选到两个新的锌指蛋白基因ZNF268和ZNF300。研究结果表明这两个基因都能够编码含有KRAB结构域的锌指蛋白。已有的研究数据表明这两个基因所编码的蛋白能够作为转录因子存在于细胞中,且都具有转录抑制功能。同时早期的研究结果也提示ZNF268和ZNF300基因同胚胎发育、血细胞分化有一定的关联性,而且免疫组化结果也提示这两个基因可能与白血病的发生相关联。尽管如此,对于其具体功能及作用机制我们还研究不多。ZNF268基因能编码多种蛋白产物,其中包含有ZNF268a和ZNF268b2。在研究过程中我们发现ZNF268a和ZNF268b2的亚细胞定位有极大的差异。其中ZNF268a含有KRAB结构域和锌指结构域,定位于细胞核中；而ZNF268b2不含有KRAB结构域,仅含有锌指结构域,在细胞质和细胞核中都存在。这一结果提示KRAB结构域可能具有入核的功能。实验表明ZNF268b2之所以在细胞质和细胞核中都存在,并不是因为序列中存在有核输出序列(NES),而是由于缺少KRAB结构域。我们将ZNF268a、ZNF300及其他锌指蛋白的KRAB结构域单独表达之后检测其亚细胞定位发现KRAB结构域的入核功能具有普遍性。进一步的研究发现KRAB结构域的入核功能与其氨基酸序列的保守位点密切相关,而且KRAB结构域的入核依赖于它与其共转录抑制因子KAP1的相互作用。由于KAP1中与KRAB结合的RBCC结构域不入核,因此,当RBCC突变之后KRAB结构域的入核能力有较大的提高,而RBCC过表达则会抑制KRAB的入核功能。另外研究还发现KRAB结构域并不能直接与核转运蛋白Importin α/β相互作用,而需要KAP1的参与才能与Irnportin α/β形成核输入复合物进入到细胞核中。结合文献报道,我们提出了如下的KRAB结构域入核模型,即KRAB结构域通过RBCC结构域与KAP1直接作用,而KAP1则能够与HP1结合,在HP1的NLS序列的作用下,这些蛋白同核转运蛋白Importin α/β形成核输入复合物一起进入到细胞核中。相较于ZNF268基因较为深入的研究,对ZNF300基因的功能却知之甚少。早期研究认为ZNF300基因可能与白血病的发生和发展有关联,因此我们以人红白血病细胞系K562为模型研究了ZNF300基因在其诱导分化过程中的作用。研究结果表明,当诱导K562细胞分别向巨核系或者是红系分化时,ZNF300基因无论在mRNA水平还是在蛋白质水平其表达都有较明显的上升,而且这种变化在巨核系分化过程中更加明显。随后以重组慢病毒载体介导的RNA干扰方式构建了下调ZNF300基因的K562稳转细胞系。以构建的稳转细胞系为模型,研究发现ZNF300表达下调之后,K562细胞被诱导分化至巨核系或者是红系的能力被显著的抑制；而且细胞增殖实验表明ZNF300基因的下调能非常显著的促进K562细胞的增殖。通过分析其细胞周期变化发现当ZNF300基因表达下调之后,处于G0/G1期的细胞比例明显减少,而S期的细胞比例显著增加,这说明ZNF300基因的表达下调能促进K562细胞从G0/G1期进入S期,从而促进细胞增殖。而ZNF300基因的表达下调造成K562细胞周期的这种改变可能是通过抑制抑癌基因p15和p27的表达,同时促进PCNA的表达来实现的。因此,我们认为ZNF300基因可能通过促进细胞增殖来实现对细胞分化的抑制。综合以上结果,我们发现了KRAB型锌指蛋白的一些新的功能及特性。一般认为KRAB锌指蛋白入核依靠位于其锌指结构域的核输入序列,但是我们的结果显示KRAB结构域也具有入核能力,并且KRAB结构域的这种入核能力可以将GFP蛋白特异性的载入到细胞核中。另外研究结果也表明KRAB型锌指蛋白ZNF300在K562细胞诱导分化过程中其表达量持续上升；下调ZNF300基因的表达,K562田胞诱导分化能力被抑制,细胞增殖速度加快。研究其分子机制时发现ZNF300下调后K562细胞的细胞周期调控蛋白表达发生显著变化,同时细胞周期发生改变,这可能是影响细胞分化的因素之一。

全文目录


论文创新点  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-11
中英文缩略对照表  11-16
第一章 锌指蛋白概述  16-27
  1.1 引言  16-17
  1.2 锌指蛋白的发现  17-18
  1.3 锌指蛋白简介  18-19
  1.4 C2H2型锌指蛋白  19-25
    1.4.1 C2H2型锌指基序的结构及其DNA结合活性  19-21
    1.4.2 C2H2型锌指蛋白的分类  21-23
    1.4.3 C2H2型锌指蛋白的生化功能  23-25
  1.5 C2H2型锌指蛋白的应用  25-27
第二章 KRAB型锌指蛋白概述及ZNF268与ZNF300研究进展  27-60
  2.1 引言  27-28
  2.2 KRAB结构域简介  28-31
    2.2.1 KRAB结构域的一般构成  28-29
    2.2.2 KRAB结构域的转录抑制功能  29-30
    2.2.3 KRAB结构域转录抑制功能的机制  30-31
  2.3 KRAB型锌指蛋白的核定位  31-40
    2.3.1 大分子物质的核运输  31-39
    2.3.2 KRAB锌指蛋白的锌指结构域发挥核定位功能  39-40
  2.4 KRAB型锌指蛋白的功能  40-50
    2.4.1 KRAB锌指蛋白与器官发育  40-41
    2.4.2 KRAB锌指蛋白与造血分化  41-49
    2.4.3 KRAB锌指蛋白与疾病  49-50
  2.5 ZNF268的研究进展  50-54
    2.5.1 ZNF268基因的结构特点  50-52
    2.5.2 ZNF268基因的功能  52-54
  2.6 ZNF300的研究进展  54-60
    2.6.1 ZNF300的基因结构  54-55
    2.6.2 ZNF300基因的表达谱  55-56
    2.6.3 ZNF300基因下游靶标基因的核心结合序列  56
    2.6.4 ZNF300基因的功能  56-60
第三章 锌指蛋白KRAB结构域入核功能研究  60-99
  摘要  60
  3.1 引言  60-62
  3.2 实验材料与仪器  62-66
    3.2.1 实验材料  62-65
    3.2.2 实验仪器  65-66
  3.3 实验方法  66-82
    3.3.1 细胞总RNA的提取  66
    3.3.2 反转录cDNA第一链的合成  66-67
    3.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  67
    3.3.4 载体构建  67-74
    3.3.5 细胞培养  74-75
    3.3.6 细胞转染  75-76
    3.3.7 Confocal实验  76-77
    3.3.8 GST pull-down实验  77-78
    3.3.9 Western Blot实验  78-81
    3.3.10 Co-IP实验  81-82
  3.4 实验结果  82-97
    3.4.1 KRAB结构域入核功能的普遍性  82-87
    3.4.2 KRAB结构域入核功能的关键氨基酸位点  87-91
    3.4.3 KRAB结构入核机制研究  91-97
  3.5 讨论  97-99
第四章 ZNF300促进K562细胞诱导分化的功能研究  99-135
  摘要  99
  4.1 引言  99-100
  4.2 实验材料与仪器  100-104
    4.2.1 实验材料  100-104
    4.2.2 实验仪器  104
  4.3 实验方法  104-115
    4.3.1 悬浮细胞培养  104-105
    4.3.2 细胞计数  105
    4.3.3 悬浮细胞诱导分化  105
    4.3.4 流式细胞仪检测细胞表面分子的比例  105-106
    4.3.5 瑞氏-吉姆萨染色  106
    4.3.6 实时定量RT-PCR  106-108
    4.3.7 Western Blot  108
    4.3.8 Benzidine染色  108
    4.3.9 下调ZNF300表达的shRNA载体构建  108-112
    4.3.10 慢病毒颗粒的包装  112-113
    4.3.11 慢病毒颗粒感染细胞及筛选稳转细胞系  113
    4.3.12 嘌呤霉素杀灭曲线的确定  113-114
    4.3.13 悬浮细胞电转筛选稳转细胞系  114
    4.3.14 DAPI染色检测细胞周期变化  114-115
  4.4 实验结果  115-133
    4.4.1 ZNF300基因在K562细胞向巨核系诱导分化过程中的变化  115-118
    4.4.2 ZNF300基因在K562细胞向红系分化过程中的表达变化  118-121
    4.4.3 特异性下调ZNF300基因表达的shRNA慢病毒载体构建  121-124
    4.4.4 下调ZNF300表达的稳转细胞系的构建  124-126
    4.4.5 ZNF300基因的表达下调之后对巨核系分化的影响  126-128
    4.4.6 ZNF300基因的表达下调之后对红系分化的影响  128-130
    4.4.7 ZNF300基因的表达下调之后对细胞增殖的影响  130-131
    4.4.8 ZNF300基因的表达下调对细胞周期的影响  131-133
  4.5 讨论  133-135
第五章 小鼠胚胎发育全基因组表达谱芯片分析  135-152
  摘要  135
  5.1 引言  135-137
  5.2 实验材料与方法  137-141
    5.2.1 实验材料  137-138
    5.2.2 实验方法  138-141
  5.3 实验结果与数据分析  141-150
    5.3.1 小鼠胚胎发育过程中基因表达概况  141-143
    5.3.2 差异基因的表达模式和功能分析  143-149
    5.3.3 基因使用效率的不同反应物种进化上的差异  149-150
  5.4 讨论  150-152
研究总结与展望  152-155
参考文献  155-178
博士研究生期间发表及待发表的论文  178-180
致谢  180-182

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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