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酿酒酵母的比较功能基因组学研究和遗传育种

作　者: 郑道琼
导　师: 赵宇华
学　校: 浙江大学
专　业: 微生物学
关键词: 酿酒酵母燃料乙醇基因组基因组结构变异非整倍体
分类号: Q933
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

燃料乙醇是第一个实现大规模生产应用的生物质可再生能源,主要通过酿酒酵母发酵转化淀粉和糖类原料获得。当前,燃料乙醇的生产应用仍面临诸多资源与成本制约因素,主要集中在原料受到土地和水资源限制、生产过程能耗高及废料处理等难题。针对燃料乙醇的生产现状,世界各国学者和工程技术人员认为高温发酵、浓醪发酵和非粮纤维乙醇三种发酵技术是提升燃料乙醇经济与社会效益的有效途径。但这几种发酵技术的运用对酿酒酵母菌株耐受环境中生长和发酵抑制因子(如高温、高渗、高乙醇浓度和纤维原料抑制物乙酸、糠醛及酚类物质)的能力提出了更苛刻的要求。研究酿酒酵母对这些胁迫因子的耐性机制,以及选育具高抗逆性和乙醇转化率的酿酒酵母菌株成为了突破这些新发酵技术瓶颈的关键所在,也是一项具有重大理论与实际应用意义的科学研究课题。本文主要通过比较功能基因组学研究方法,揭示不同酿酒酵母菌株间的基因组差异,以及这些差异如何影响菌株的耐性和发酵性能。同时也利用基因组变构和基因工程等方法来选育性能改进的酿酒酵母菌株。主要研究内容和结果如下：1、燃料乙醇工业菌株的耐受性和发酵性能比较选取实验室菌株Z1和乙醇发酵工业上常用的酿酒酵母Z2-Z7系列菌株,研究比较其对高温等胁迫抑制因子的耐受性及其在高温、浓醪和纤维素水解液三种条件下的发酵性能。结果表明,即便是同一生产用途的酿酒酵母菌株在多种胁迫耐受性和发酵性能上存在显著差别、各具优势。相比之下,菌株Z7(ZT系列)在浓醪条件下的乙醇产量和糖醇转化率上要明显优于其它常用工业菌株,菌株Z5在高温条件下乙醇产量最高,菌株Z3对纤维素水解液中抑制物耐性要高于其它菌株。2、比较功能基因组学指导菌株个性化育种对工业菌株YJS329(Z5)和实验室菌株BYZ1进行表型比较分析,发现Z5在对多种环境胁迫因子耐性和发酵性能上要优于BYZ1。两菌株在海藻糖、质膜成分和抗氧化因子等生化因子的含量上也有明显差异。脉冲场凝胶电泳(PFGE)和比较基因组杂交结果表明,Z5是一株核型规则的二倍体菌株。利用二代高通量测序技术对Z5的一株单倍体菌株YJSH1进行深度测序和从头组装,并与S288c基因组进行了SNP、进化关系、Indel和ORF的差异分析。利用RNA-Seq研究了该两株菌株的表达谱,在基因表达水平上对两株菌株的表型差异进行机制探讨。重点分析了转录因子MSN2/4,HAP1,HSFl,和ARR1自身表达差异原因和对整个表达谱和菌株表型的影响。同时结合基因组序列信息举例分析了一些SNPs、Indels和基因拷贝数变化对基因表达的影响。在了解Z5基因组信息以及一些序列变异对表型的影响后,用基因操作的方法对Z5进行针对性的分子改造,并提出了比较功能基因组学指导微生物个性化育种的育种新理念。3、基因组结构变异对菌株表型的影响及其机制利用PFGE和比较基因组杂交对菌株Z2-7进行了基因组结构比较,结果显示Z3和Z5是二倍体菌株,Z2,Z4,Z6和Z7是非整体菌株,在多条染色体上发生大片段的扩增现象。综合菌株Z2-7的DNA序列进化关系、表型和生理生化的分析的结果,我们推测基因组结构变异在这些菌株表型分化中的作用可能比序列差异的作用大。通过对CUP1和YFL052W等特定基因的过表达和敲除发现这些基因的拷贝数变化会对菌株的表型产生显著影响。此外,对Z7和Z5在生长和发酵条件下的表达谱和生理生化比较研究发现,“非整倍压力应激”可能是这些菌株胁迫耐性和发酵性能差异的重要机制。4、通过基因组结构变异改进菌株的复杂性状对Z7进行多轮的基因组重构后,获得浓醪发酵性能显著提高的SV突变株,证明了基因组变构能有效改进酵母菌株的复杂性状。其中一株突变株ZTS3较Z7在乙醇产量上提高6.6%,而且对乙醇、H202和高温的耐受性也明显改进。ZTS3相对于Z7来说在多条色体上发生了大片段的拷贝数增多或减少。我们证明了基因YFL052V拷贝数和表达量的增加是ZTS3多种胁迫耐性提高的一个重要原因。对ZTS3和Z7所有差异基因的功能分类及相关生理代谢分析发现,ZTS3的非整倍压力应激反应要少于Z7,具体反映在参于核苷酸等小分子的合成、细胞增殖、海藻糖和抗氧化因子等抗逆因子合成基因在ZTS3上调；参于蛋白折叠、转运和定位、能量代谢和离子平衡等过程的基因在ZTS3中发生下调。因此推断：特定基因拷贝数的变化和非整倍性的调整是基因组变构改进菌株复杂性状的两种重要机制。

全文目录

致谢  8-9
英文缩略词  9-10
摘要  10-12
Abstract  12-15
第一章文献综述  15-26
  1.1 酿酒酵母的倍性和基因组结构  15-16
  1.2 酿酒酵母种群进化和种内基因组差异  16-22
    1.2.1 不同菌株的亲缘关系  16-18
    1.2.2 基因组序列差异  18-20
      1.2.2.1 SNPs  18
      1.2.2.2 插入和缺失(Indels)  18-19
      1.2.2.3 新基因  19-20
    1.2.3 基因组结构变异  20-22
      1.2.3.1 倒位  20
      1.2.3.2 易位  20-21
      1.2.3.3 大片段插入和丢失  21
      1.2.3.4 基因拷贝数变异  21-22
      1.2.3.5 酿酒酵母的非整倍化  22
  1.3 基因组差异对表型的影响  22-24
    1.3.1 蛋白序列差异对表型影响  22-23
    1.3.2 基因表达调控对表型影响  23-24
  1.4 总结与展望  24
  1.5 本工作研究目的与研究内容  24-26
第二章不同燃料乙醇酿酒酵母的胁迫耐受性和发酵性能比较  26-33
  2.1 前言  26-27
  2.2 材料  27-28
    2.2.1 菌株  27
    2.2.2 主要试剂  27
    2.2.3 培养基的配制  27-28
    2.2.5 主要仪器  28
  2.3 方法  28-29
    2.3.1 发酵性能测定  28
      2.3.1.1 发酵工艺和数据统计  28
      2.3.1.2 代谢产物分析  28
    2.3.2 酵母耐受性测定  28-29
  2.4 结果与讨论  29-31
    2.4.1 菌株多种胁迫条件下耐性比较  29-30
    2.4.2 发酵性能比较  30-31
  2.5 本章小结  31-33
第三章比较功能基因组学指导菌株个性化育种  33-57
  3.1 前言  33
  3.2 材料  33-36
    3.2.1 菌株  33
    3.2.2 主要试剂和试剂盒  33-34
    3.2.3 实验试剂的配制  34-36
      3.2.3.1 海藻糖测定试剂  34
      3.2.3.2 脂肪酸含量测试所用试剂  34
      3.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳所用试剂  34-35
      3.2.3.4 酵母细胞染色所用试剂  35
      3.2.3.5 酵母细胞醋酸锂转化所用试剂  35
      3.2.3.6 脉冲场凝胶电泳(PFGE)所用试剂  35-36
    3.2.4 培养基的配制  36
    3.2.5 主要仪器  36
  3.3 方法  36-44
    3.3.1 大肠杆菌感受态制备和转化  36-37
    3.3.2 醋酸锂转化酿酒酵母  37
    3.3.3 生理生化指标测定  37-38
    3.3.4 脉冲场凝胶电泳(PFGE)对酵母核型的分析  38-39
      3.3.4.1 酵母菌染色体DNA样品制备  38-39
      3.3.4.2 脉冲场凝胶电泳(PFGE)  39
    3.3.5 比较基因组杂交(aCGH)  39
    3.3.6 全基因组测序  39-40
    3.3.7 RNA-Seq表达谱分析  40
    3.3.8 实时定量PCR(qPCR)  40
    3.3.9 基因操作  40-44
  3.4 结果  44-54
    3.4.1 菌株YJS329和BYZ1的表型和生理生化分析  44-45
    3.4.2 菌株YJS329的基因组结构分析  45-47
    3.4.3 菌株YJS329的全基因组测序  47-49
      3.4.3.1 单核苷酸多态性  47
      3.4.3.2 Indels  47
      3.4.3.3 ORFs  47-49
    3.4.4 菌株YJS329与BYZ1的表达谱分析  49-53
    3.4.5 功能基因组学指导YJS329个性化育种  53-54
  3.5 讨论  54-56
  3.6 本章小结  56-57
第四章基因组结构变异对酿酒酵母表型的影响  57-77
  4.1 前言  57-58
  4.2 材料  58-60
    4.2.1 菌株与质粒  58
    4.2.2 主要试剂  58-59
    4.2.3 实验试剂配制  59
    4.2.4 培养基的配制  59
    4.2.5 实验仪器  59-60
  4.3 方法  60-61
    4.3.1 PFGE和比较基因组杂交  60
    4.3.3 表型和生理生化分析  60-61
  4.4 实验结果  61-71
    4.4.1 不同燃料乙醇菌株基因组结构比较和进化关系  61-62
    4.4.2 特定基因拷贝数变化对菌株耐受性的影响  62-63
    4.4.3 大范围结构变异与菌株特定耐性和发酵性能的相关性  63-66
    4.4.4 基因组结构变异对菌株表达谱的影响  66-71
  4.5 讨论  71-76
  4.6 本章小结  76-77
第五章利用基因组结构变异改进菌株的复杂性状  77-95
  5.1 前言  77-78
  5.2 材料  78-79
    5.2.1 菌株  78
    5.2.2 主要试剂  78
    5.2.3 实验试剂的配制  78
    5.2.4 培养基的配制  78-79
    5.2.5 实验仪器  79
  5.3 方法  79-81
    5.3.1 酵母产孢杂交  79
    5.3.2 酵母相对DNA含量测定  79
    5.3.3 浓醪发酵  79
    5.3.4 菌株耐受力测定  79-80
    5.3.5 PFGE和比较基因组杂交  80
    5.3.6 RNA-Seq  80
    5.3.7 iTRAQ蛋白组分析  80
    5.3.8 基因操作  80-81
  5.4 结果  81-92
    5.4.1 SVs突变株的获得和性能测定  81-83
    5.4.2 ZTS3与Z7的基因组结构比较分析  83-84
    5.4.3 ZTS3基因组结构变异对ZTS3复杂性状的影响机制  84-92
  5.5 讨论  92-93
  5.6 本章小结  93-95
第六章全文总结及后续工作建议  95-99
  6.1 全文总结  95-97
  6.2 主要创新点  97
  6.3 后续工作建议  97-99
参考文献  99-108
攻读学位期间发表论文  108

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