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低能离子注入选育高酶活L-半胱氨酸转化菌株及相关酶基因研究

作　者: 陈旭
导　师: 陈蔚青
学　校: 浙江工业大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: L-半胱氨酸假单胞菌低能离子注入基因克隆培养基优化
分类号: TQ922
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

L-半胱氨酸是一种在医药、食品、化妆品等行业得到广泛应用的脂肪族氨基酸,是合成谷胱甘肽、硫胺素、生物素等重要生物化学制品的原料,市场需求量相当大。目前,L-半胱氨酸主要通过传统的毛发水解后还原法、化学合成方法得到,不仅产量低、产品不专一且污染严重。微生物酶转化生产L-半胱氨酸因其具有反应条件温和、专一性强、对环境友好等优点而备受关注。本文在实验室前期研究基础上,对微生物酶法转化DL-2-氨基-A2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)生产L-半胱氨酸的菌株进行诱变选育,对诱变菌株产L-半胱氨酸酶系相关基因的基因序列及蛋白质序列进行比对分析以及对菌体产酶培养基及罐体发酵条件进行优化。以具有L-半胱氨酸转化能力的Pseudomonas sp. B-3为出发菌株,采用低能N+注入诱变技术对其能进行诱变处理,筛选获得了一株高酶活,且遗传稳定的突变菌株Pseudomonas sp. C-25,其最佳底物浓度由原来的25g/L提高到30g/L,最高酶活为2748U/mL,与原菌株相比提高了26.3%。为探究酶活性提高的分子机制,分别扩增了出发菌株Pseudomonassp.B-3和突变菌株Pseudomonas sp. C-25产L-半胱氨酸酶系中的L-ATC水解酶,N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)水解酶和L-半胱氨酸脱巯基酶基因并对其基因序列及蛋白质序列进行了比较。并利用I-TASSER模拟以上3种酶的蛋白质三维结构。由序列比对及蛋白质结构模拟结果可知,经诱变后,L-ATC水解酶基因序列的203th核苷酸由原来的A变为G,相应的68th氨基酸由原来的天冬氨酸(Asp)变为甘氨酸(Gly),且突变位点发生在酶结合位点Asp68处,说明突变可能改变了结合位点结构,使得酶活力有所提高。L-NCC水解酶基因序列的212th核苷酸由原来的T变为C,相应的71th氨基酸由原来的异亮氨酸(Ⅱe)变为苏氨酸(Thr)；1052th核苷酸由原来的C变为T,相应的351th氨基酸由原来的组氨酸(His)变为酪氨酸(Tyr),且突变位点71th与酶结合位点Arg70非常接近,苏氨酸和酪氨酸都是极性氨基酸,可推断这两个氨基酸残基可能改变了该酶的亲水性,进而改变了酶的活性。L-半胱氨酸脱巯基酶基因930th核苷酸由原来的C变为G,相应的301th氨基酸由原来的半胱氨酸(Cys)变为色氨酸(Try),465th核营酸由原来的G变为T,而氨基酸序列无变化,为无意突变。该酶基因突变位点没有发生在酶结合位点附近,可推测对酶活及酶稳定性无太大影响。这些信息为该酶系的进一步研究奠定了一定的基础。为优化Pseudomonas sp. C-25的产酶条件,利用单因数实验和响应面法对突变株的产酶培养基组成进行了优化。优化结果为：DL-ATC·3H2O4.7g/L、甘油16.0g/L、牛肉膏6.5g/L、酵母膏4.0g/L蛋白胨5.0g/L、氯化钠3.0g/L、MnSO4H2O0.02g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L。在优化培养基条件下,诱变菌株的酶活力达3301U/mL,较优化前提高了18.6%。在摇瓶发酵的基础上,利用7L NBS BioFlo415原位灭菌发酵罐进行发酵实验。通过溶氧量(DO)关联控制通气量和搅拌转速的方法增加了调控的可操作性。菌体在溶氧量为30～40%时菌体酶活力最高。通过对诱导剂DL-ATC·3H2O添加时间的优化,确定了在进入对数生长期时(2h)添加最为合适,其酶活达到4668U/mL,较摇瓶发酵提高了41.4%。此外,发酵时间较摇瓶提前了10h左右。此时菌体Pseudomonas sp. C-25转化DL-ATC·3H2O生成L-半胱氨酸的最高质量浓度为15.1g/L。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-16
第一章文献综述  16-27
  1.1 L-半胱氨酸简介  16-21
    1.1.1 L-半胱氨酸的理化性质  16
    1.1.2 L-半胱氨酸的应用  16-17
    1.1.3 L-半胱氨酸的生产方法  17-21
      1.1.3.1 毛发水解法  17-18
      1.1.3.2 微生物转化法  18-21
  1.2 低能离子注入诱变在育种中的应用  21-24
    1.2.1 离子注入的特点  21
    1.2.2 离子注入的诱变机理  21-22
    1.2.3 离子注入与传统诱变方法的比较  22-23
    1.2.4 离子注入诱变在育种中的应用  23-24
      1.2.4.1 在植物育种上的应用  23
      1.2.4.2 在微生物育种方面的运用  23-24
      1.2.4.3 低能离子注入在遗传改良方面的应用  24
  1.3 蛋白质结构预测研究进展  24-25
  1.4 论文思路  25-27
第二章材料与方法  27-33
  2.1 菌种  27
  2.2 实验材料  27-29
    2.2.1 主要试剂  27
    2.2.2 培养基  27-28
    2.2.3 菌体培养条件及方法  28
    2.2.4 转化条件及方法  28
    2.2.5 主要仪器和设备  28-29
  2.3 有关参数分析方法  29-32
    2.3.1 生物量测定—比浊法  29
    2.3.2 细胞生物量的测定  29-30
    2.3.3 L-半胱氨酸测定  30-31
    2.3.4 DL-ATC测定  31-32
  2.4 酶活定义  32-33
第三章离子注入选育高酶活L-半胱氨酸转化菌株  33-39
  3.1 引言  33
  3.2 实验材料  33
    3.2.1 菌种  33
    3.2.2 培养基  33
    3.2.3 主要试剂  33
    3.2.4 主要仪器和设备  33
  3.3 实验方法  33-34
    3.3.1 菌种培养方法  33-34
    3.3.2 菌悬液的制备  34
    3.3.3 靶样的制备  34
    3.3.4 N~+注入处理  34
    3.3.5 高酶活突变株的筛选  34
  3.4 结果与讨论  34-38
    3.4.1 不同N~+注入剂量下菌株的存活率曲线  34-35
    3.4.2 N~+注入剂量对假单胞菌B-3突变率的影响  35
    3.4.3 高酶活突变菌株的筛选  35-36
    3.4.4 突变菌株稳定性的考察  36-37
    3.4.5 诱变菌株Pseudomonas sp.C-25的生长曲线和产酶曲线  37
    3.4.6 诱变菌株Pseudomonas sp.C-25底物耐受性研究  37-38
  3.5 本章小结  38-39
第四章突变株产L-半胱氨酸相关酶基因分析及蛋白质三维结构预测  39-54
  4.1 引言  39
  4.2 材料与方法  39-40
    4.2.1 菌种和材料  39
    4.2.2 培养基和溶液  39-40
    4.2.3 实验仪器和设备  40
  4.3 实验方法  40-42
    4.3.1 模板DNA的制备  40
    4.3.2 目的基因的克隆  40-42
      4.3.2.1 引物设计  40-41
      4.3.2.2 PCR扩增目的基因  41
      4.3.2.3 与T载体连接  41-42
  4.4 转化和筛选鉴定  42-43
    4.4.1 感受态细胞的制备  42
    4.4.2 转化反应  42-43
    4.4.3 测序、序列分析及蛋白质结构模拟  43
  4.5 结果与讨论  43-53
    4.5.1 PCR结果  43-44
    4.5.2 重组载体的转化和蓝白斑筛选  44-45
    4.5.3 诱变前后菌体中产L-半胱氨酸酶系中各种酶基因序列及蛋白质序列比对分析及其蛋白质三维结构模拟  45-53
  4.6 本章小结  53-54
第五章突变菌株Pseudomonas sp.C-25的产酶工艺优化  54-66
  5.1 引言  54
  5.2 材料与方法  54-55
    5.2.1 菌种  54
    5.2.2 培养基  54
    5.2.3 菌体培养条件  54
    5.2.4 转化条件及转化液  54-55
    5.2.5 分析方法  55
  5.3 结果与讨论  55-65
    5.3.1 不同种类碳源对菌体生长和酶活的影响  55-56
    5.3.2 甘油浓度对菌体生长和产酶的影响  56
    5.3.3 各种氮源的不同浓度对菌体生长和酶活的影响  56-57
    5.3.4 不同浓度的DL-ATC·3H_2O对菌体生长和酶活的影响  57-58
    5.3.5 不同浓度的NaCl对菌体生长和酶活的影响  58
    5.3.6 不同浓度的Mg~(2+)对菌体生长和酶活的影响  58-59
    5.3.7 不同浓度的Mn~(2+)对菌体生长和酶活的影响  59
    5.3.8 Plackett-Burman实验  59-61
    5.3.9 最陡爬坡实验  61-62
    5.3.10 Box-Behnken实验设计  62-65
    5.3.11 验证实验  65
  5.4 本章小结  65-66
第六章 Pseudomonas sp.C-257L发酵罐规模化产酶条件优化  66-72
  6.1 前言  66
  6.2 材料与方法  66-67
    6.2.1 菌种  66
    6.2.2 培养基  66
    6.2.3 菌体培养条件及方法  66-67
    6.2.4 转化条件及转化液  67
    6.2.5 主要仪器  67
    6.2.6 实验方法  67
      6.2.6.1 摇瓶种子培养  67
      6.2.6.2 7L罐发酵培养  67
    6.2.7 分析方法  67
      6.2.7.1 生物量测定  67
      6.2.7.2 L-半胱氨酸测定  67
      6.2.7.3 酶活力测定  67
  6.3 结果及讨论  67-71
    6.3.1 溶氧量对Pseudomonas sp.C-25产酶的影响  67-68
    6.3.2 7L罐Pseudomonas sp.C-25生长和产酶曲线  68-69
    6.3.3 诱导剂的不同添加时间对菌体生长及酶活的影响  69-70
    6.3.4 菌体产L-半胱氨酸转化曲线  70-71
  6.4 本章小结  71-72
第七章结论和建议  72-74
  7.1 结论  72-73
  7.2 建议  73-74
参考文献  74-82
攻读硕士期间发表的文章  82-83
致谢  83

低能离子注入选育高酶活L-半胱氨酸转化菌株及相关酶基因研究

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