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一.研究背景冠心病(CAD)是严重威胁人类健康的重要疾病之一,在我国,随着人民生活水平的提高,CAD的发病率亦在逐年升高。传统资料表明,低水平的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)是CAD的一个独立危险因素,HDL-C水平与CAD的发生率及死亡率呈负相关,但近年来研究发现HDL-C水平高低并不准确代表高密度脂蛋白(HDL)的整体功能。HDL具有多种抗动脉粥样硬化(AS)功能,国际上将具有正常HDL功能的HDL称之为功能HDL(Functional HDL):包括逆胆固醇转运(RCT)、抗炎抗氧化、改善内皮细胞功能失调及抗血栓及促纤溶等。HDL的血管保护作用在很大程度上是由于其介导了RCT,即HDL将胆固醇从周围组织(包括动脉粥样硬化斑块)转运到肝脏进行再循环或以胆酸的形式排泄的过程。RCT过程中,其中ATP结合盒转运子A1 (ABCA1)、清道夫受体BI (SR-BI)及载脂蛋白A1 (Apo-A1)对其介导起到了关键的作用。抗氧化是HDL的另一个重要功能。在基础状态下HDL可抑制低密度脂蛋白(LDL)氧化磷脂生成,并将已生成的氧化磷脂灭活。目前认为,与HDL抗氧化功能相关的酶最为重要并有代表意义的为屏氧酶1(PON1),其次还有Apo-A1卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)和血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)等。已有资料显示HDL其中的抗氧化酶——PON1与抗氧化、CAD密切相关,不仅CAD组PON1活性及浓度明显高于正常对照组,而且其活性及浓度还与冠脉病变严重程度呈负相关。但是,在多种因素所致的慢性炎症及急性期反应的状态下,HDL的正常功能会发生缺失,甚至表现出与其正常功能相反的作用,主要表现为促炎、促氧化和抑制RCT等促AS作用,即成为“失功能HDL (Dysfunctional HDL) "。HDL作为多功能的蛋白复合体,其蛋白的修饰直接关系到HDL颗粒的整体功能。多个实验证实髓过氧化物酶(MPO)参与了动脉壁脂蛋白氧化修饰过程,研究人员从人的AS斑块处提取出了具有酶活性MPO,并且发现其与病变处的HDL有关。MPO选择性氧化修饰Apo-AI,导致酪氨酸残基硝化和氯化,同时减少ABCA1依赖的胆固醇外流。因此,目前认为MPO是失功能HDL发生的可能原因之一。噻唑烷二酮类药物(TZDs),如罗格列酮,是过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARy)主要的合成激动剂,也是口服降糖药之一。近来有研究发现,TZDs除了降血糖效果优于磺脲类等降糖药外,还能直接影响血管细胞,通过抑制多种炎症因子(如C-反应蛋白、白介素2、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ等)、调控细胞周期和诱导细胞凋亡等途径,抑制平滑肌细胞、血管内皮细胞及单核/巨噬细胞的增殖和迁移,降低炎症反应,还能通过诱导与HDL代谢相关基因SR-B1、ABCA1、三磷酸腺苷结合盒转运子G1 (ABCG1)的表达来促进巨噬细胞-泡沫细胞胆固醇逆转运,维持细胞内脂质的平衡,抑制AS发生。但有关罗格列酮在AS模型中对与HDL功能相关的PON1活性、MPO活性及主动脉斑块内细胞上ABCA1、SR-B1的影响,国内外鲜有报道。因此,我们通过建立AS兔模型,研究罗格列酮对改善HDL功能的影响及其机制。二.研究目的我们以动脉粥样硬化(AS)兔模型为研究对象,观察肝细胞、主动脉斑块内细胞ABCA1、SR-BI表达和HDL抗炎抗氧化功能的改变在AS形成中的作用,同时分析在AS状态下罗格列酮对上述指标的影响,从而探讨罗格列酮通过何种机制改善HDL功能发挥抗AS作用。三.研究方法1、实验分组18只新西兰健康雄性大白兔(体重2.0±0.11Kg,合格证号：scxk粤2006-0015)随机分为：(1)正常对照组(n=6)：给予普通饮食喂养；(2)动脉粥样硬化(AS)组(n=6)：予以高脂饲料；(3)罗格列酮组(n=6)：在饲以高脂饮食基础上给予罗格列酮[0.5mg/(kg·d)]。2、血脂检测分别于实验第0周和第12周取血清,采用酶法在全自动生化分析仪上测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平(单位mmol/L)3、HDL抗炎抗氧化功能的检测收集实验第12周的血清标本,采用乙酸苯酯法测定屏氧酶1(PON1)活性；髓过氧化物酶(MPO)活性用MPO试剂盒在分光光度计上测定。4、肝细胞及主动脉壁斑块内细胞上的HDL受体ABCA1及SR-B1的检测(1)肝组织总RNA的提取用Trizol提取法,实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)进行相对定量检测肝细胞ABCA1及SR-BI mRNA的表达量。(2)免疫组化法标记主动脉ABCA1及SR-BI受体表达情况,使用Image pro plus 6.0图片分析软件分析主动脉壁斑块内细胞上ABCA1或SR-B1的蛋白表达情况：包括其表达平均光密度值和其表达面积百分比。5、病理组织学观察主动脉斑块形成情况实验第12周收集主动脉标本,10%中性甲醛固定液固定,常规制组织石蜡切片,苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察其组织病理改变,,并测量其内中膜厚度(IMT)及动脉斑块/血管面积比。6、统计方法所有计量资料均以均数±标准差(x±s)表示,并采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,实验12周三组兔血脂情况比较采用协方差分析,组间两两比较采用LSD法；实验开始时三组兔血脂情况、实验12周三组兔血清PON1和MPO活性变化、实验12周三组兔肝组织ABCA1和SR-B1 mRNA的表达、实验12周三组兔主动脉IMT比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差不齐时用Welch校正检验,多重比较方差齐性时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’sT3法检验。两组间比较采用两独立样本t检验,各组实验前后比较采用配对t检验,各组测得的血清PON1活性及MPO活性分别与主动脉内中膜厚度进行两变量间的Pearson相关分析。P<0.05为差异有显著性。四.研究结果1、入组前各组动物间血清总胆固醇(TC)(P=0.525,F=0.672)、甘油三酯(TG)(P=0.665, F=0.420)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(P=0.978, F=0.023)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C) (P=0.505, F=0.614)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) (P=0.982,F=0.018)、非高密度脂蛋白胆固醇(NHDL-C) (P=0.473,F=0.788)的差异无统计学意义,入选实验动物基线统一。12周后,各组进行组间比较实验：与正常对照组相比,AS组血清TC (23.26±3.30 vs 1.79±0.21, P=0.000)、TG(1.58±0.25 vs 1.02±0.15,P=0.000)、LDL-C(18.09±4.04 vs 1.09±0.23, P=0.000)、VLDL-C(4.06±1.42 vs 0.25±0.14, P=0.000)、HDL-C (1.11±0.09 vs 0.45±0.12, P=0.000)、NHDL-C (22.15±3.22 vs 1.34±0.10, P=0.000)水平显著升高,其差异有统计意义；与AS组相比,罗格列酮组血清HDL-C (1.94±0.30 vs 1.11±0.09,P=0.000)水平显著升高,TC(19.78±1.68 vs 23.26±3.30, P=0.010)、VLDL-C(2.28±1.03vs4.06±1.42, P=0.008)、NHDL-C (17.51±1.43 vs22.15±3.22, P=0.002)显著降低,其差异均有统计学意义；但血清LDL-C(15.57±1.81 vs 18.09±4.04, P=0.118)水平无显著改变。3组兔血脂各项指标分别进行实验干预前后(0周/12周)比较：正常对照组普通饲料喂养前后血清TC (1.85±0.12vs 1.79±0.21, t=0.538, P=0.614)、TG(1.04±0.19vs1.02±0.15,t=0.162, P=0.878)、LDL-C (1.00±0.20vs 1.09±0.23, t=-0.566, P=0.596)、VLDL-C (0.38±0.10vs0.25±0.14, t=1.485, P=0.198)、HDL-C (0.47±0.12vs0.45±0.12, t=0.369, P=0.727)、NHDL-C (1.38±0.14vs 1.34±0.10, t=0.475, P=0.655)无显著改变。AS组高脂饲料干预前后血清TC (1.77±0.15vs 23.26±3.30,t=-16.603,P=0.000)、TG(1.10±0.14vs1.58±0.25,t=-4.498,P=0.006)、LDL-C (1.00±0.20vs18.09±4.04, t=-10.251, P=0.000)、VLDL-C (0.30±0.11 vs 4.06±1.42, t=-6.061, P=0.002)、HDL-C (0.48±0.12 vs 1.11±0.09, t=-14.615, P=0.000)、NHDL-C (1.29±0.14vs22.15±3.22, t=-16.045, P=0.000)显著升高。罗格列酮组干预前后血清TC (1.78±0.12 vs 19.78±1.68, t=-25.288, P=0.000)、TG(1.02±0.14vs1.54±0.15,t=-5.184,P=0.004),LDL-C(0.98±0.14vs15.57±1.81, t=-20.228, P=0.000)、VLDL-C (0.34±0.20 vs 2.28±1.03, t=-4.247, P=0.008)、HDL-C (0.47±0.07vs1.94±0.30, t=-10.561, P=0.000)、NHDL-C (1.32±0.11vs 17.511±1.43, t=-26.067, P=0.000)显著升高。2、实验12周后,3组兔血清屏氧酶1(PON1)活性变化：与正常对照组比较,AS组血清PONl活性[(72.26±12.03) U/ml vs (96.77±5.58) U/ml, P=0.000]显著降低,而罗格列酮组[(105.18±8.49) U/mlvs (72.26±12.03) U/ml, P=0.000]较AS组显著升高。3、实验12周后,3组兔血清髓过氧化物酶(MPO)活性变化：与正常对照组(14.94±6.36)U/L比较,AS组血清MPO活性[(85.67±17.92)U/L vs (14.94±6.36)U/L,P=0.000]显著升高,而罗格列酮组[(54.45±10.99)U/L vs (85.67±17.92) U/L,P=0.018]较AS组显著降低。4、实验12周后,3组兔肝细胞ABCA1及SR-B1 mRNA相对表达情况(用2-△△CT表示)：与正常对照组相比,AS组ABCA1 mRNA (0.61±0.12vs 1.00±0.03, P=0.001)和SR-BI mRNA (0.63±0.11 vs 1.00±0.02, P=0.001)表达量明显减少,差异有统计意义；与AS组相比,罗格列酮组ABCA1 mRNA (1.29±0.27 vs0.61±0.11,P=0.003)和SR-BI mRNA (0.63±0.11 vs 1.39±0.23, P=0.000)表达量明显增加,差异有统计意义。5、实验12周后,HE染色观察3组兔主动脉内中膜厚度(IMT)及斑块面积的组织病理学特点：电子显微镜下观察各组主动脉见正常对照组血管内膜光滑,连续,内皮细胞完整；AS组血管内膜明显增厚,血管腔明显缩小；与正常对照组比较,AS组主动脉内中膜增厚(527.42±85.16μm vs 203.21±30.6μm, P=0.000),差异有统计学意义。与AS组比较,罗格列酮组主动脉内中膜(291.46±50.18μm vs 527.42±85.16μm, P=0.000)、斑块／血管内膜表面积百分比显著减小(5.88±3.31%vs 27.78±12.00%, t=4.304,P=0.002),差异均有统计学意义。6、实验12周后,免疫组化染色观察主动脉斑块内细胞上ABCA1及SR-B1表达情况并用Image-plus6.0图像分析软件进行分析：与AS组比较,罗格列酮组的主动脉斑块内细胞上ABCA1表达平均光密度值(0.22±0.03 vs 0.17±0.03, t=-2.661,P=0.024)及ABCA1表达面积百分比(%)(47.06±4.93vs24.13±9.85, t=-5.100, P=0.000)明显增加；其主动脉斑块内细胞上SR-B1表达平均光密度值(0.20±0.03 vs 0.18±0.03, t=-0.756,P=0.467)及SR-BI表达面积百分比(%)(24.74±13.04 vs 18.81±7.58, t=-0.964,P=0.358)亦增加,但无明显统计学差异。7、血清PON1活性与主动脉内中膜厚度(r=-0.675,P=0.002)呈显著负相关关系,血清MPO活性与主动脉内中膜厚度(r=0.774,P=0.000)呈显著正相关关系。五.结论1、罗格列酮降低AS兔血清TC、VLDL-C及NHDL-C水平,升高血清HDL-C水平。2、罗格列酮通过上调AS兔主动脉斑块内细胞上ABCA1的表达及肝细胞上ABCA1、SR-B1的表达,促进HDL逆胆固醇转运(RCT)作用。3、罗格列酮通过增加PON1活性,降低MPO活性以增强AS兔的HDL抗氧化、抗炎功能。4、罗格列酮明显减轻AS状态下的主动脉内中膜厚度(IMT)及斑块／血管内膜表面积百分比,发挥减轻AS斑块形成的作用。5、HDL-C是血清HDL颗粒中的胆固醇水平,并不是准确代表HDL功能的指标,罗格列酮不仅升高HDL-C水平从而提高HDL中胆固醇的数量,而且更加重要的是,通过增强主动脉斑块内细胞及肝细胞ABCA1、SR-BI的表达及改善PON1、MPO活性,从而改善HDL功能,增加其抗AS功能,以减轻AS斑块形成。
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