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罗格列酮对环孢素A所致大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

作　者: 石新慧
导　师: 李红；刘章锁
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: 环孢素A 罗格列酮 肾小管上皮细胞 凋亡
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 8次
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内容摘要


[背景和目的]环孢素A（Cyclosporine A,CsA）是器官移植后免疫抑制、抗排斥反应以及多种免疫性疾病治疗的一线药物,其临床应用显著改善了实体器官移植的近期存活率,但CsA的应用会导致肾脏毒性,成为限制其临床应用的主要原因,主要病理特征为肾小管上皮细胞的凋亡和坏死,以及不可逆的肾间质纤维化。既往研究发现肾素-血管紧张素系统（Renin-giotensin System,RAS）的激活、转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor-beta 1,TGF-β1）、一氧化氮以及过氧化物酶体增殖物受体一γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-γ,PPARγ）的激活等因素可能参与了CsA肾毒性的发生发展过程,近来研究发现凋亡在CsA肾毒性的发生机制中具有重要作用。过氧化物酶体增殖因子活化受体（peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs）是一类由配体激活的转录因子,属Ⅱ型核激素受体超家族成员。已肯定的有三种亚型:α、β、γ,该类受体具有组织分布和配体特异性,PPARs在控制炎症反应、脂质代谢,细胞增生和分化等方面发挥重要作用,近来有研究报道PPARγ可参与细胞凋亡的调节。罗格列酮（rosiglitazone,ROZ）属噻唑烷二酮类（thiazolidinediones,TZDs）胰岛素增敏剂,是过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）的合成配基,与PPARγ结合后可激活许多基因的转录,因此,具有多种生物学效用。现已有报道罗格列酮在防治CsA导致的肾器质性病变中具有保护作用。本研究用大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,经体外培养实验法,观察CsA对NRK-52E细胞凋亡的影响,并初步探讨罗格列酮对CsA致NRK-52E细胞凋亡的拮抗作用。[方法]1.分组:常规方法体外培养NRK-52E细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养液将细胞培养于37℃、5%CO2的恒温培养箱,正常培养的NRK-52E细胞分为七组:（1）正常对照组;（2）CsA损伤组（0.2μg/L）;（3）CsA损伤组（2.0μg/L）;（4）CsA损伤组（20μg/L）;（5）罗格列酮干预组（CsA20μg/L+ROZ5μmol/L）;（6）罗格列酮干预组（CsA20μg/L+ROZ10μmol/L）;（7）罗格列酮干预组（CsA20μg/L+ROZ15μmol/L）。细胞融合率达40%～50%时用血清饥饿法同步化24h,然后按上述分组加药处理,继续培养达24h时用以下方法进行研究。2.利用倒置显微镜观察加药24h时细胞形态学的变化。3.采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测加药24h时上述各组细胞的凋亡率。4.蛋白印迹分析（Western-blotting）检测加药24h时各组细胞Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达情况。[结果]1.细胞的形态变化:细胞经CsA处理24h时,在倒置显微镜下观察发现对照组细胞贴壁生长良好,呈铺路石样,边界清楚,可见较多核分裂相;与对照组细胞相比,随着CsA浓度的增加,细胞损伤程度及数量明显增加。CsA0.2μg/L组有极少量细胞在24h后出现了空泡化、回缩、变圆、与周围细胞脱离,CsA2μg/L及20μg/L组贴壁细胞结构不完整,可见较多细胞发亮变圆,由于细胞脱落增多导致贴壁细胞密度明显变稀,给予ROZ干预后,各组细胞损伤情况均有所改善,与CsA损伤组相比有显著性差异。2.细胞凋亡率:24h时流式细胞仪显示对照组细胞凋亡率平均值为5.06%,而CsA损伤组则呈剂量依赖性地诱导NRK细胞发生凋亡,凋亡率分别升至11.45%、20.06%、28.91%,与对照组相比明显增加（P＜0.01）;孵育24h后罗格列酮干预组均可下调CsA（20μg/L）诱导的NRK细胞的凋亡率,凋亡率分别降至27.32%、21.32%和15.55%,以ROZ10μmol/L组及15μmol/L组最为显著（P＜0.01）。3.Bax:与对照组相比,CsA呈剂量依赖性地促进Bax蛋白的表达（P＜0.01）,Bax蛋白平均灰度值从对照组的0.088±0.013分别升至0.307±0.010、0.415±0.011和0.614±0.013,而孵育24h后ROZ干预组则显著下调CsA（20μg/L）导致的Bax蛋白高表达（P＜0.01）,蛋白灰度值分别下降至0.412±0.041、0.316±0.028和0.113±0.009,各组间比较具有显著性差异（P＜0.01）。4.Caspase-3:对照组Caspase-3蛋白灰度值为0.080±0.007,而CsA呈剂量依赖性地促进Caspase-3蛋白的高表达（P＜0.01）,Caspase-3蛋白灰度值分别上升至0.357±0.009、0.595±0.004和0.639±0.01 3,孵育24h后ROZ干预组显著下调CsA（20μg/L）引起的Caspase-3蛋白的高表达（P＜0.01）,蛋白灰度值分别下降至0.494±0.011、0.331±0.023和0.211±0.029。各组间比较具有显著性差异（P＜0.01）。5.Bcl-2:与对照组相比,CsA呈剂量依赖性地抑制Bcl-2蛋白的表达（P＜0.01）,Bcl-2蛋白平均灰度值从0.689±0.013分别降至0.512±0.030、0.384±0.038和0.190±0.025,孵育24h后ROZ干预组显著上调CsA（20μg/L）引起的Bcl-2蛋白低表达（P＜0.01）,蛋白灰度值分别上升至0.419±0.009、0.518±0.008和0.633±0.015。各组间比较具有显著性差异（P＜0.01）。[结论]1.环孢素A在体外呈浓度依赖性地诱导NRK-52E细胞发生凋亡。2.罗格列酮在体外可以抑制环孢素A所致的NRK-52E细胞凋亡,其抑制程度与罗格列酮的浓度呈正相关。3.罗格列酮抑制环孢素A所致NRK-52E细胞凋亡的作用与上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax、Caspase-3蛋白的表达有关。

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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