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褐飞虱对寄主营养恶化及高种群密度的分子应答

作　者: 罗冰青
导　师: 华红霞
学　校: 华中农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 褐飞虱环境胁迫转录组测序分析差异表达谱测序分析 real-time PCR
分类号: S435.112.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

褐飞虱(Nilaparavata lugens)是一种重要的水稻害虫,其成虫具有长、短翅型两型现象。自然条件下,水稻营养条件差种群密度增大时易产生长翅型；水稻营养条件良好种群密度较小时易产生短翅型。长翅型迁飞,繁殖力较弱；短翅型发育快,繁殖力强,危害性大,但不能迁飞。研究褐飞虱对寄主营养恶化及高种群密度下的分子应答反应,对揭示褐飞虱灾变的内在原因具有重要意义。本研究通过黄熟期寄主和高虫口密度环境,构建恶化的营养胁迫条件；通过健壮的分蘖期寄主水稻和低虫口密度环境,构建适宜生存条件。比较褐飞虱在两种条件下的基因表达差异,得到褐飞虱环境胁迫应答基因。在NDSC诱导条件(寄主为黄熟期水稻,高虫口密度)和NRCC诱导条件(寄主为分蘖期水稻,低虫口密度)下,分别得到两组虫样,每组虫样从2龄到5龄取了8个时间段的样品,通过分析其在不同条件下表达谱差异,揭示其其对不良营养条件的分子应答机制。主要研究结果如下：1、褐飞虱转录组测序分析：通过Solexa法对褐飞虱转录组测序,共测得1,682,583,750个碱基对,组装后共得到76406条Unigene。将Unigene序列与蛋白数据库NR、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对,得到了Unigene功能注释,并进行转录组COG与GO功能分类。此外,转录组测序分析还做了Unigene的KEGG代谢通路分析,预测编码蛋白框(CDS)分析。褐飞虱转录组测序分析完成了转录水平上大规模的基因测序,为褐飞虱差异表达谱测序分析提供了参考序列。2、褐飞虱差异表达谱测序分析：我们对ND3.2(即在NDSC条件下3龄第2天)和NR3.2(在NRCC条件下3龄第2天)若虫文库测序。测序后分别产生了290万和300万的clean tag,这其中又分别有71672和83592个差异clean tag。将clean tag与参考基因数据库对比,对其中唯一比对到一个基因的clean tag进行基因注释,同时获得标准化的基因表达量。由此从ND3.2和NR3.2两个文库中共筛选出1203个上调基因和1341个下调基因。3、选取了脂质代谢、糖类代谢、氨基酸代谢、翅发育及肌肉发育途径、激素代谢、卵巢发育途径,共6类与环境胁迫有密切关系的基因,从表达谱中筛选出这6类差异表达基因,基因数分别为58、34、58、15、7、8个,共计180个统计了这些基因在每个类别中的差异表达情况。根据相对差异较大和表达量较高的标准又从这6类中分别选择了6、2、3、3、3、2个,共计19个基因。4、对这19个基因进行real-time PCR验证,分别得到了这些基因在NDSC和NRCC条件下不同龄期中的基因差异表达情况。实验结果显示差异表达结果与表达谱分析基本相符。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
1 前言  10-17
  1.1 褐飞虱的危害及特点  10
  1.2 寄主营养条件对昆虫生长发育的影响  10-11
  1.3 种群密度对昆虫生长发育的影响  11-12
  1.4 寄主营养条件对昆虫翅型的影响  12-13
  1.5 种群密度对昆虫翅型的影响  13-14
  1.6 环境胁迫条件对昆虫生理生化特性及代谢的影响  14-15
  1.7 环境胁迫条件对昆虫分子特性的影响  15
  1.8 Solexa测序技术的概况  15-17
2 材料与方法  17-31
  2.1 试验材料  17-20
    2.1.1 供试昆虫  17
    2.1.2 主要试剂耗材  17-19
    2.1.3 主要仪器  19-20
  2.2 试验方法  20-31
    2.2.1 褐飞虱胁迫处理及对照  20
    2.2.2 trizol法抽提总RNA  20-22
      2.2.2.1 试验材料预处理  20-21
      2.2.2.2 抽提褐飞虱总RNA  21
      2.2.2.3 RNA琼脂糖凝胶电泳检测  21
      2.2.2.4 总RNA的浓度测定  21-22
    2.2.3 褐飞虱转录组分析  22-24
    2.2.4 褐飞虱表达谱分析方法  24-27
    2.2.5 褐飞虱总RNA的反转录  27-29
    2.2.6 差异表达基因的选择  29
    2.2.7 实时荧光定量PCR(real-time PCR)  29-31
3 实验结果  31-49
  3.1 褐飞虱若虫总RNA抽提结果  31
  3.2 总RNA的浓度测定  31
  3.3 转录组结果  31-36
    3.3.1 测序产生序列的基本信息  31-32
    3.3.2 Unigene的长度分布及匹配度  32
    3.3.3 gap占Unigene长度百分比统计  32-33
    3.3.4 Unigene在nr数据库中同源性比对相似度情况  33-34
    3.3.5 Unigene的GO分类  34-35
    3.3.6 Unigene的COG分类  35-36
  3.4 表达谱结果  36-41
    3.4.1 褐飞虱差异表达谱产生的tag数据  37
    3.4.2 总clean tag数和差异表达clean tag数在不同丰富度上的分布  37-38
    3.4.3 差异表达基因的GO功能分类  38-40
    3.4.4 褐飞虱在环境胁迫条件下差异表达基因的选择  40-41
  3.5 褐飞虱总RNA的反转录  41-42
  3.6 差异表达基因的real-time PCR结果  42-49
4 讨论  49-52
  4.1 褐飞虱总RNA的抽提  49
  4.2 转录组结果  49-50
  4.3 表达谱结果  50-51
  4.4 反转录结果  51
  4.5 real-time PCR验证  51-52
参考文献  52-59
致谢  59

褐飞虱对寄主营养恶化及高种群密度的分子应答

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