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马铃薯块茎休眠与发芽抑制差减cDNA文库构建及相关功能基因克隆

作　者: 刘柏林
导　师: 司怀军
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 植物学
关键词: 马铃薯块茎休眠与发芽抑制差减cDNA文库 ARF基因电子克隆 Real time-PCR
分类号: S532
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

马铃薯在我国乃至世界都是第四大粮食作物。马铃薯块茎的休眠与发芽对于马铃薯的种植栽培以及生产加工极为重要。关于马铃薯块茎休眠与发芽的研究大都集中在储藏生理、遗传及细胞生物学方面。生产实践中主要通过低温或者化学抑制剂来控制储存块茎的发芽。然而,低温储存会产生低温糖化影响马铃薯的加工品质,使用化学药剂抑制发芽不断增加人们对环境和经济的担忧。由于目前对块茎休眠和发芽机理了解欠缺,人工调控技术发展缓慢,制约了马铃薯种薯的生产和块茎作为工业加工原料的充分利用。研究块茎休眠和发芽的分子机理及调控,对于马铃薯栽培、贮藏保鲜和产业的发展等具有十分重要的意义。本研究旨在通过分离和克隆马铃薯块茎休眠与发芽相关基因,初步揭示参与块茎休眠与发芽的基因的种类和数量,为进一步研究休眠与发芽的分子机制提供理论基础和技术支持。取得的主要研究结果如下:1.利用抑制差减杂交技术(SSH)构建了一个马铃薯块茎休眠与发芽相关基因片段的差减文库。经初步筛选和测序获得310个有效EST片段,BLASTn和BLASTx比对分析发现34条EST为未知功能序列,其余EST均可推测出其同源基因或者蛋白功能。2.初步分析发现所获得EST序列涉及糖类代谢、蛋白质代谢、能量代谢、核酸转录与翻译、信号传导、膜转运、细胞结构以及细胞的分裂与生长等一系列生物学过程。利用GO分类标准对EST从细胞组分,生物过程和分子功能进行了2级水平分类。随机选取的13个差异表达基因用Real-time PCR检测分析,证明其在块茎休眠与发芽过程中上调表达或者下调表达。3.从块茎发芽与休眠相关SSH cDNA文库中筛选了一个与ARF基因同源的EST阳性克隆片段,经过电子克隆获得了ARF基因的cDNA全序列,分析属于马铃薯的ARF1基因。Real time-PCR组织特异性分析表明,ARF基因在马铃薯块茎中优势表达。4.分别对20℃和4℃储存的收获后1周、收获后4周、芽眼萌动、芽长2 mm、芽长5 mm和芽长大于10 mm的马铃薯块茎中ARF基因的相对表达量分析表明,在马铃薯块茎的休眠解除过程中,ARF基因的表达量呈下降上升下降变化趋势,突破芽眼和芽长超过1 cm为两个转折点。对成熟收获、室温储存45天芽眼萌动和室温储存90天芽长2～5mm的试管薯中ARF基因的相对表达量分析表明也呈下降上升的趋势,突破芽眼为马铃薯块茎解除休眠的一个重要时期。ARF基因在块茎中的优势表达和表达量的变化说明其可能参与调控马铃薯块茎的休眠与发芽生理。

全文目录

缩略语表  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章前言  10-29
  1.1 课题的提出  10-11
  1.2 前人研究工作  11-23
    1.2.1 马铃薯块茎的休眠与发芽  11-12
    1.2.2 马铃薯块茎的休眠与发芽生理研究  12-16
    1.2.3 马铃薯块茎休眠与发芽的分子机理研究  16-19
    1.2.4 马铃薯块茎休眠与发芽的分子调控研究  19-21
    1.2.5 马铃薯块茎休眠与发芽的物理化学调控研究  21-23
  1.3 抑制差减杂交方法原理与应用  23-28
    1.3.1 SSH 技术的基本原理  24
    1.3.2 SSH 技术主要过程  24-26
    1.3.3 SSH 技术评价  26-27
    1.3.4 SSH 技术在植物研究中的应用  27-28
  1.4 本研究的目的与内容  28-29
    1.4.1 研究目容  28
    1.4.2 研究内容  28-29
第二章马铃薯块茎休眠与发芽相关抑制差减杂交CDNA 文库构建  29-77
  2.1 前言  29
  2.2 材料与方法  29-41
    2.2.1 供试材料及处理  29-30
    2.2.2 主要试剂  30
    2.2.3 休眠与发芽马铃薯块茎Total RNA 提取  30
    2.2.4 ds cDNA 合成  30-31
    2.2.5 SMARTer ds cDNA Column Chromatography  31-32
    2.2.6 双链cDNA 的Rsa I 酶切  32
    2.2.7 酶切产物纯化  32-33
    2.2.8 接头连接  33-34
    2.2.9 差减杂交  34-36
    2.2.10 两次PCR 选择性扩增  36-37
    2.2.11 差减效率检测  37
    2.2.12 差减产物克隆及差减文库生成  37-39
    2.2.13 差减文库初步筛选与测序  39
    2.2.14 序列分析与功能注释  39
    2.2.15 RT-PCR 验证差异基因  39-41
  2.3 结果分析  41-70
    2.3.1 RNA 的浓度和纯度  41-42
    2.3.2 双链cDNA 的合成  42-43
    2.3.3 双链cDNA 的RsaⅠ酶切分析  43-44
    2.3.4 接头连接及连接效率检测  44
    2.3.5 差减产物两次PCR 扩增结果  44-45
    2.3.6 差减效率检测  45-46
    2.3.7 差减文库生成及文库质量检测  46
    2.3.8 差减文库筛选及测序结果  46-65
    2.3.9 序列分析及功能分类与注释  65-67
    2.3.10 RT-PCR 验证差异表达基因  67-70
  2.4 讨论  70-77
    2.4.1 马铃薯块茎总RNA 提取  70-71
    2.4.2 差减文库构建  71-72
    2.4.3 马铃薯块茎休眠与发芽相关基因  72-77
第三章马铃薯ARF 基因CDNA 克隆及其在块茎休眠解除过程中的表达分析  77-89
  3.1 前言  77
  3.2 材料与方法  77-80
    3.2.1 试验材料  77-78
    3.2.2 药品试剂  78
    3.2.3 试验方法  78-80
  3.3 结果分析  80-87
    3.3.1 马铃薯ARF 基因序列拼接及分析  80-82
    3.3.2 马铃薯块茎总RNA 提取及ARF 基因cDNA 序列扩增  82-83
    3.3.3 马铃薯ARF 基因cDNA 进化树分析  83-84
    3.3.4 马铃薯块茎ARF 基因组织特异性表达分析  84-85
    3.3.5 马铃薯块茎ARF 基因在不同储存温度下由休眠到发芽过程中的表达变化.  85-86
    3.3.6 马铃薯块茎在不同储存时间点ARF 基因的表达变化  86-87
  3.4 讨论  87-89
参考文献  89-104
致谢  104-105
作者简介  105-106
导师简介  106-107

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