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两个玉米转录因子ZmC4HC3和ZmNAC的克隆与表达分析

作　者: 崔庆新
导　师: 李玉玲
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 胚乳 转录因子 电子克隆 基因表达 生物信息学
分类号: S513
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


玉米胚乳占粒重的80%-85%,其发育程度对籽粒产量及品质起着至关重要的作用。本研究在课题组利用玉米小粒爆裂玉米自交系N04和大粒马齿型玉米自交系丹232构建授粉后10d和20 d两个胚乳发育关键时期差异表达EST库的基础上,选取初步预测功能为锌指蛋白和NAC转录因子的两条EST,利用电子克隆和RT-PCR的方法成功克隆了3条全长cDNA序列,并进行了功能预测、亚细胞和染色体初步定位以及同源性比较,同时还对锌指蛋白基因进行了时空表达分析。主要结果如下：1.以爆裂玉米自交系N04胚乳早期库(授粉后10 d)表达、初步预测功能为锌指蛋白转录因子的一条EST(PE12C5)为种子序列,利用电子克隆和RT-PCR方法成功克隆了玉米锌指蛋白基因ZmC4HC3,GenBank登录号为GQ131520.1。该基因全长为1504bp,编码区有942bp,5’非编码区为185bp,3’非编码区有377bp。CDS序列中含有942bp完整的开放阅读框,推测其编码一条具有314个氨基酸的肽链；蛋白结构域预测,显示其含有保守的RINGV(C4HC3)结构域。2.对ZmC4HC3编码蛋白进行系统进化分析发现,其与高粱、水稻锌指蛋白都有较高同源性,分别为90%和85%,而与拟南芥锌指蛋白等的同源性较低,为70%。通过ZmC4HC3基因CDS序列与B73(B73 RefGen)比对,推测该基因位于玉米第一染色体Binl.10位点。3.以马齿型玉米自交系丹232胚乳早期库表达、初步预测功能为NAC转录因子的一条EST(DE57D10)为种子序列,采用电子延伸和RT-PCR方法克隆了该基因的两个转录文本ZmNAC和ZmNAC2,基因登陆号为HM347322和HM367095。ZmNAC基因全长1267bp, CDS序列中含有897bp,编码299个氨基酸,5’非编码区有79bp,3’非编码区有291bp。ZmNAC2基因全长1359bp,编码区有534bp,编码有178个氨基酸,5’非编码区有79bp,3’非编码区有745bp。蛋白结构域预测,显示其都含有保守的NAM结构域,属于NAC类转录因子。4.蛋白系统进化分析发现, ZmNAC转录因子与水稻NAC类同源性为86%、与小麦NAC类中NAC同源性为80%,ZmNAC2编码蛋白与水稻、小麦中NAC类有较高同源性,分别为83%和80%。蛋白结构预测ZmNAC、ZmNAC2编码蛋白含有保守的NAM结构域。并对这两个转录文本所编码蛋白其进行了生物信息学的分析。5.采用实时荧光定量PCR方法,对ZmC4HC3基因在马齿型玉米自交系丹232和爆裂玉米自交系N04不同籽粒发育时期和不同组织器官的表达分析表明,该基因在授粉后10d胚乳中的表达量丹232中高于N04,10d-20d表现为N04大于丹232；在两个自交系根、茎、叶、果皮、胚和胚乳中均表达,无组织特异性,但表达量存在差异,授粉后10d时N04和丹232叶中表达较强,胚乳中表达较弱；20d时N04茎中表达较强,胚中表达较弱,丹232种皮中表达较强,胚乳中表达较弱。6.根据生物信息学分析,ZmC4HC3编码RINGV型的锌指蛋白,与水稻已克隆的粒重相关基因GW2同样属于指环蛋白的一种,具有E3泛素连接酶的活性；ZmNAC和ZmNAC2与水稻中已经克隆的粒重相关基因OsNAC6编码的蛋白的同源性59%。推测这3个基因可能与玉米粒重有关,可以作为玉米粒重候选基因进一步研究。

全文目录


致谢  4-7摘要  7-9第一章 文献综述  9-18  1.1 植物转录因子研究进展  9-11    1.1.1 转录因子研究背景  9    1.1.2 转录因子结构特征  9-10    1.1.3 植物中的转录因子  10-11  1.2 植物锌指蛋白转录因子研究进展  11-14    1.2.1 锌指蛋白转录因子  11    1.2.2 锌指蛋白的发现和分类  11-12    1.2.3 锌指蛋白的作用机理  12-13    1.2.4 RING型锌指蛋白与蛋白质泛素化  13-14  1.3 植物NAC转录因子研究进展  14-16    1.3.1 NAC转录因子简介  14    1.3.2 NAC转录因子的结构特征  14    1.3.3 NAC转录因子的生物学功能  14-16  1.4 基于EST的全长基因克隆方法  16  1.5 本研究的目的和意义  16-18第二章 玉米锌指蛋白转录因子ZmC4HC3基因的克隆与表达分析  18-40  2.1 材料与方法  18-23    2.1.1 田间种植材料和取样方法  18    2.1.2 EST种子序列来源及功能  18    2.1.3 目的基因的全长cDNA克隆方法  18-22    2.1.4 DNA序列测定和分析  22    2.1.5 基因功能的生物学分析工具  22    2.1.6 基因表达分析方法  22-23  2.2 结果与分析  23-37    2.2.1 目标EST的全长cDNA序列克隆、测序及序列分析  23-26    2.2.2 ZmC4HC3编码蛋白的结构域和理化性质分析  26-28    2.2.3 ZmC4CHC3编码蛋白的二级和三级结构分析  28-30    2.2.4 磷酸化位点预测和跨膜结构分析  30-33    2.2.5. 亚细胞定位预测和染色体初步定位  33-34    2.2.6 ZmC4HC3编码蛋白系统进化分析  34-35    2.2.7 ZmC4HC3基因的荧光定量表达分析  35-37  2.3 讨论  37-40    2.3.1 电子克隆中的一些常见问题和对策  37-38    2.3.2 关于ZmC4HC3基因的染色体位置和功能  38-39    2.3.3 ZmC4HC3编码蛋白的跨膜结构与其功能  39-40第三章 玉米NAC类转录因子两个转录本的克隆与生物信息学分析  40-58  3.1 材料与方法  40-41    3.1.1 EST种子序列来源及功能预测  40    3.1.2 目的基因的电子克隆方法  40    3.1.3 玉米功能基因电子克隆相关的生物信息资源  40    3.1.4 目的基因的PCR扩增  40    3.1.5 质粒提取与序列测定  40-41  3.2 结果与分析  41-55    3.2.1 ZmNAC基因的延伸、扩增及克隆测序  41-47    3.2.2 ZmNAC基因编码蛋白的的生物信息学分析  47-55  3.3 讨论  55-58    3.3.1 玉米ZmNAC基因的选择性剪切  55-56    3.3.2 ZmNAC与ZmNAC2编码蛋白质性质差异  56-58参考文献  58-68ABSTRACT  68-69

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 玉米（玉蜀黍）
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