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副猪嗜血杆菌ompP5、cdtABC免疫原性分析和间接ELISA检测方法的建立

作　者: 王雷
导　师: 何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 副猪嗜血杆菌 ompP5 cdtABC 免疫原性 间接ELISA
分类号: S855.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属于革兰氏阴性菌,来自于巴斯德菌科的嗜血菌属,是革拉瑟氏病(Glasser)的病原体,长期栖息在猪群上呼吸道,在机体免疫力低下时侵入机体引发严重的全身性疾病,典型临床病变特征表现为以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等,威胁当前养猪业最重要细菌性病原之一,给当前养殖业造成巨大经济损失。目前预防该病注射的疫苗为主要以高毒力血清型4型和5型菌株作为灭活苗,由于副猪嗜血杆菌血清型众多,菌株间毒力差异也较大,目前灭活苗能不同时对所有致病菌产生交叉保护。随着对副猪嗜血杆菌高毒力菌株全基因组测序的完成,可以利用分子生物学手段进行基因工程疫苗的研究。本研究基于本实验室对5型高毒力副猪嗜血杆菌SH0165菌株测序完成及后续研究发现18个在HPS流行菌株为保守基因或操纵子基因,选择了ompP5、cdtABC基因进行克隆表达,并将三个蛋白分别免疫Balb/C小鼠研究其免疫原性。主要研究内容如下：1.副猪嗜血杆菌ompP5、cdtABC基因的克隆表达及免疫原性分析根据GenBank中的副猪嗜血杆菌序列设计引物,分别扩增ompP5、cdtA、cdtB和cdtC基因,然后将四个基因分别克隆到表达载体pET-28a(+)和pGEX-KG上,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,经诱导表达和纯化后得到四种重组蛋白。将四种重组蛋白进行乳化,免疫Balb/C小鼠,初次免疫弗氏完全佐剂,二次免疫弗氏不完全佐剂,二免两周后用5×LD5o的副猪嗜血杆菌SH0165攻毒。并设立分组如下：试验组一(灭活全菌)、试验组二(ompP5)、试验组三(cdtA)、试验组四(cdtB)、试验组五(cdtC)、试验组六(ompP5+cdtA+cdtB+cdtC)和PBS对照组。通过监测抗体发现,cdtA和cdtC的免疫原性高于cdtB组,但低于全菌免疫组。而在免疫后的攻毒保护力实验中,cdtB重组蛋白免疫组保护率为60%高于cdtA(40%)和cdtC(40%)蛋白免疫组,与灭活全菌免疫组保护率(60%)相同。ompP5蛋白的免疫原性和攻毒保护力(40%)均低于灭活全菌免疫。结果显示四种重组蛋白都有一定的免疫原性,其中cdtB能提供与灭活全菌免疫相同的保护力。2.副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法的建立及应用利用四种重组蛋白作为包被抗原确定最佳包被浓度和血清稀释浓度,并优化其他相关反应条件,建立了重组蛋白包被的间接ELISA检测方法,并建立了灭活全菌包被抗原间接ELISA方法和超声破碎抗原间接ELISA作为对照。临床检测中与灭活全菌包被间接ELISA检测方法符合率为81.7%,无显著性差异(P>0.05)；与超声破碎抗原包被间接ELISA检测方法符合率为78.7%,有显著性差异(P<0.05)。但三种方法监测阳性率趋势相同,故四种重组蛋白抗原包被的间接ELISA检测方法可行。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略语表  12-13
第1章 文献综述  13-23
  1.1 副猪嗜血杆菌流行病学研究进展  13-14
    1.1.1 血清学分型  13
    1.1.2 基因分型  13-14
  1.2 致病性研究进展  14-18
    1.2.1 致病机理的研究  14
    1.2.2 致病因子的相关研究  14-18
  1.3 诊断方法的研究进展  18-20
    1.3.1 细菌的分离培养和生化鉴定  18
    1.3.2 分子生物学诊断方法  18-19
    1.3.3 免疫组化诊断方法  19
    1.3.4 血清学诊断方法  19-20
  1.4 疫苗研究进展  20-23
    1.4.1 全菌灭活疫苗  21-22
    1.4.2 基因工程亚单位疫苗  22-23
第2章 副猪嗜血杆菌OMPP5、CDTABC基因的克隆表达及免疫原性分析  23-43
  2.1 材料  23-25
    2.1.1 菌种、质粒  23
    2.1.2 主要试剂  23
    2.1.3 实验动物  23
    2.1.4 主要培养基及相关试剂的配制  23-25
  2.2 实验方法  25-34
    2.2.1 引物的设计  25
    2.2.2 副猪嗜血杆菌SH0165菌株的复苏  25
    2.2.3 副猪嗜血杆菌SH0165菌株全菌基因组DNA的提取  25-26
    2.2.4 PCR扩增靶基因  26
    2.2.5 PCR产物回收与纯化  26-27
    2.2.6 目的片段与表达载体的双酶切与回收  27-28
    2.2.7 目的基因与载体的连接  28
    2.2.8 E.coliDH5a感受态细胞的制备  28
    2.2.9 连接产物的转化  28-29
    2.2.10 质粒的小量提取  29
    2.2.11 重组质粒的PCR鉴定  29
    2.2.12 重组质粒的双酶切鉴定  29
    2.2.13 E.coliBL21(DE3)感受态细胞的制备  29-30
    2.2.14 重组质粒的诱导表达  30
    2.2.15 SDS-PAGE鉴定  30
    2.2.16 包涵体的复性  30-31
    2.2.17 重组蛋白浓度的测定(Bradford法)  31
    2.2.18 重组蛋白的Western-Blot检测  31-32
    2.2.19 小鼠的免疫及攻毒试验  32
    2.2.20 攻毒  32-33
    2.2.21 血清特异性抗体检测  33-34
  2.3 结果与分析  34-41
    2.3.1 omp5、cdtABC基因的克隆及重组质粒的构建  34-36
    2.3.2 重组蛋白的诱导表达及纯化  36-37
    2.3.3 组蛋白的Western-Blot免疫验证  37
    2.3.4 鼠血清特异性抗体动态变化  37-39
    2.3.5 副猪嗜血杆菌对Balb/C小鼠的致病性试验  39-40
    2.3.6 Balb/C小鼠免疫攻毒保护试验  40-41
  2.4 讨论  41-43
第3章 副猪嗜血杆菌间接ELISA检测方法的建立及应用  43-54
  3.1 材料  43
    3.1.1 主要试剂  43
    3.1.2 试验菌株和血清  43
    3.1.3 试验器材  43
  3.2 试验方法  43-46
    3.2.1 间接ELISA包被抗原的制备  43-44
    3.2.2 间接ELISA方法的操作程序  44
    3.2.3 间接ELISA方法条件的优化  44-45
    3.2.4 间接ELISA方法的应用  45-46
  3.3 结果与分析  46-52
    3.3.1 间接ELISA最优反应条件  46-49
    3.3.2 检测全菌免疫鼠血清  49-50
    3.3.3 检测不同血清型HPS免疫兔血清  50-51
    3.3.4 检测临床猪血清  51-52
  3.4 讨论  52-54
结论  54-55
参考文献  55-62
致谢  62

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 细菌病 > 杆菌病
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