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Ⅰ_1-咪唑啉受体与μ阿片受体相互作用

作　者: 马浩
导　师: 李锦；李斐
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: I1-咪唑啉受体 μ阿片受体 相互作用 受体脱敏
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


咪唑啉受体（imidazoline receptors，IR）被发现于上世纪八十年代，因对含有咪唑啉环结构的化合物表现出高亲和力而得名。目前，国外学者根据咪唑啉受体与不同配体的亲和力、组织分布、功能等方面的差异，将其分为I1R、I2R以及新近被发现的I3R三个亚型。2000年美国Piletz教授从人脑海马λgt11 cDNA文库中克隆得到了I1R候选蛋白---I1-咪唑啉受体抗血清选择蛋白（I1-imidazoline receptorantiserum-selected protein，IRAS），并证明IRAS具有I1R的受体特征。在此基础上，本实验室及国外学者进一步证明IRAS即为I1R。胍丁胺是L-精氨酸在L-精氨酸脱羧酶（L-ADC）作用下脱羧基的产物，是咪唑啉受体的内源性配体和激动剂。本实验室10余年的研究工作显示胍丁胺能够调节阿片功能。我们发现外源性胍丁胺能够增强吗啡镇痛，预防和治疗吗啡耐受、躯体依赖及精神依赖；内源性胍丁胺也具有和外源性胍丁胺类似的生物学作用。分别使用共转染μ阿片受体（Mu-opioid receptor, MOR）和I1R技术和RNA干涉技术在细胞系、原代培养的海马神经元以及整体动物水平证明胍丁胺抗阿片依赖及耐受的作用是由I1R介导的。因此，I1R可能作为一种新的非阿片受体参与了对阿片受体功能的调节。然而，到目前为止，I1R参与调节阿片依赖及耐受作用的分子机制尚不完全清楚。我们的前期研究发现，在共同转染IRAS和MOR的细胞系中，DAMGO预处理15 min能引起MOR脱敏反应与单独转染MOR细胞的MOR脱敏反应具有明显差异。那么，什么原因产生这种差异呢？在脑区分布上，I1R与MOR分布存在重叠。通过对I1R的结构分析发现，IRAS具有与其他蛋白相互作用的关键结构域。此外，近年来，越来越多的证据表明，阿片受体可以和同一家族不同亚型的受体以及非同一家族的不同G蛋白偶联受体发生相互作用，形成同源或异源二聚/寡聚化。异源二聚化/寡聚化可能是一种新的调节机制，在调节受体磷酸化、脱敏、转运等方面发挥重要作用。研究表明，某些非阿片受体，如D1多巴胺受体、α2-肾上腺素受体等参与阿片耐受和依赖重要的分子机制之一就是通过与阿片受体形成异源二聚体/寡聚体，产生直接相互作用而调节阿片功能。那么，I1R是否通过与MOR形成二聚体/寡聚体形式调节阿片功能呢？本论文以这一假设为出发点开展了研究工作。首先，我们运用细胞免疫荧光技术对MOR和IRAS亚细胞定位进行了研究。在瞬时转染Flag-MOR和Myc-IRAS的HEK293细胞中，在激光共聚焦显微镜下我们观察到Flag-MOR和Myc-IRAS两者在胞内存在共定位现象，发生共定位的亚细胞区域主要分布在胞膜。在大鼠大脑皮层及海马齿状回区神经元，免疫组化结果显示MOR与I1R存在共定位。IRAS/I1R与MOR的亚细胞共定位现象提示两者之间具有发生相互作用的可能性。之后，我们应用不同方法证明MOR与IRAS形成了异源二聚体。采用蛋白相互作用研究的经典方法免疫共沉淀技术，在瞬时转染Flag-MOR和Myc-IRAS的HEK293中发现，用抗Flag-MOR的抗体能在结合Flag-MOR的同时将Myc-IRAS共沉淀；反过来，用抗Myc-IRAS的抗体能在结合Myc-IRAS的同时将Flag-MOR共沉淀。而无论是MOR还是IRAS均不能与无关蛋白GFP发生共沉淀。为了排除瞬转导致受体高表达对实验结果的影响，在MOR和IRAS表达量相对低的CHO-IRAS/MOR细胞中，二者表达水平与文献报道其各自在天然组织中的表达量接近，MOR可以与IRAS共沉淀。以上结果提示二者可能具有相互作用。还原剂DTT高浓度（100 mM）不会破坏两者相互作用，提示二者间相互作用可能不是由二硫键介导的。MOR的激动剂DAMGO及I1R激动剂胍丁胺单用或联合应用对二者的聚合水平无显著影响，提示二者间的相互作用是激动剂非依赖型。为了确证免疫共沉淀的实验结果，运用近年新兴蛋白相互作用研究手段荧光共振能量转移技术研究二者的相互作用，研究结果进一步证实IRAS与MOR存在可能的相互作用。那么，IRAS与MOR之间的相互作用是否影响了MOR的信号转导功能呢？对阿片类药物预处理引起的代偿性适应改变，如MOR脱敏等是否会有影响呢？针对上述问题，我们以稳定转染MOR的CHO细胞（CHO-MOR）为对照，在共转MOR-IRAS的CHO细胞（CHO-MOR/IRAS）中开展了研究工作。我们发现在CHO-MOR与CHO-MOR/IRAS中，DAMGO通过激动MOR而抑制腺苷酸环化酶（AC）活性，进而使cAMP含量降低，两种细胞间无显著差别，提示IRAS与MOR的相互作用不影响MOR偶联的AC信号转导功能。在此基础上，进一步研究IRAS与MOR之间的相互作用对MOR脱敏及复敏的影响。首先，应用MOR激动剂DAMGO预处理细胞不同时间（0, 7.5 min，15 min，30 min，45 min，1 h，2 h，3 h，4 h），观察DAMGO在CHO-MOR细胞与CHO-MOR/IRAS细胞中致MOR脱敏是否具有差异。我们发现在CHO-MOR细胞中，DAMGO预处理0-4 h，MOR表现为时间依赖性脱敏，在处理4 h时脱敏程度达到约40%。而与之相比，在CHO-MOR/IRAS细胞中，DAMGO预处理0-1h（7.5 min，15 min，30 min，45 min，1h），MOR表现出先快速脱敏，后出现复敏趋势，随DAMGO预处理时间延长（1-4 h），MOR表现为时间依赖性脱敏，但脱敏速度显著小于CHO-MOR细胞，在处理4 h时，脱敏程度约20%，与CHO-MOR细胞相比具有显著性差异。之后，我们进一步研究了IRAS与MOR之间的相互作用对MOR复敏的影响。DAMGO预处理CHO-MOR与CHO-MOR/IRAS 4 h，然后洗脱药物，间隔10 min，30 min，1 h观察受体自然复敏情况。结果显示，在CHO-MOR细胞与CHO-MOR/IRAS细胞中MOR均表现出复敏趋势，但在CHO-MOR/IRAS中复敏程度大于CHO-MOR细胞，经过1 h在CHO-MOR/IRAS细胞中复敏了约13%，而CHO-MOR中MOR复敏率约9.7%。由于受体复敏与受体再循环至胞膜有关，因此，我们推测IRAS与MOR的相互作用可能影响了MOR的受体转运，导致MOR复敏速度加快。结论：本文通过不同蛋白相互作用研究方法首次证明I1R与MOR能在细胞膜上形成异源二聚体，构成了受体水平的相互作用。此相互作用可能不是由二硫键介导，且表现为非激动剂依赖特征；IRAS通过与MOR形成异源二聚体能在细胞水平降低DAMGO预处理引起的MOR脱敏，增加处于脱敏状态的MOR之复敏。受体脱敏是阿片耐受及依赖的机制之一，降低脱敏即意味着可能降低阿片耐受和依赖。本研究表明I1R通过与MOR的相互作用进而降低阿片受体脱敏，提示I1R可能是直接调控阿片功能的关键分子，从而为研究新型脱毒防复吸药物及镇痛药物提供了新的理论基础。

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