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新型药物筛选系统建立及通过hTERT通路诱导细胞凋亡的新型SERM的机制研究

作　者: Koirala; Diwa
导　师: 李大伟
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 抗癌药物 药物筛选 绿色荧光蛋白试验 SERM hTERT
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 14次
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内容摘要


药物筛选是药物研发领域中至关重要的步骤。MTT法是利用化学显色，基于药物对细胞生长繁殖抑制的抗肿瘤药物筛选方法，它作为一种标准检测方法而广泛运用。但是MTT法误差较大，而且耗费时间较长。本文建立了一种新的基于细胞的药物筛选方法，该方法是通过检测绿荧光蛋白量来评价药物的，简便易操作，节省时间而且数据可靠。我们的研究结果显示，该新方法在细胞生长曲线的准确性和灵敏度，抗肿瘤药物对细胞生长抑制的检测，药物剂量反应以及抗肿瘤药物IC50确定等方面都可以和MTT法媲美，甚至优于MTT法。运用该筛选方法我们筛选得到了一种新的雌激素受体抑制剂——化合物11#,它的细胞毒作用比tamoxifen更强。化合物11#在乳腺癌细胞系MCF7和卵巢癌细胞系SKOV3上都表现出细胞毒性的剂量和时间依赖型。荧光素酶检测显示化合物11#是一个多功能的调节因子，它可以下调由雌激素诱导的tk‐ERE启动子的荧光素酶活性，表明它可以拮抗雌激素以及地塞米松对tk‐GRE启动子的诱导作用。化合物11#能抑制MCF7细胞系中hTERT启动子的活性，而对SKOV3细胞系的hTERT启动子没有作用。免疫印记结果显示用化合物11#处理细胞后hTERT蛋白表达量下降，这一结果与荧光素酶检测结果一致，我们还发现化合物11#处理的MCF7细胞，hTERT蛋白从细胞核转移到细胞质中。而且，该化合物能抑制SKOV3细胞所引起的裸鼠肿瘤的生长。我们所有的研究结果表明化合物11#能调控特定肿瘤细胞系的hTERT表达，并且在乳腺癌和卵巢癌方面能够成为一种很有前景的抗肿瘤药物。

全文目录


Abstract  3-4
摘要  4-5
Contents  5-8
Abbreviations  8-9
PART A: FEASIBILITY OF USING STABLE UGFP‐DK1 CELL LINE AS A REPLACEMENT OF MTT ASSAY IN ANTI‐CANCER DRUG SCREENING  9-31
  INTRODUCTION  10-18
    1.1 ANTICANCER DRUG SCREENING  10-11
      1.1.1 Drug Discovery  10
      1.1.2 Drug Screening  10-11
    1.2 CELL‐BASED ANTICANCER DRUG SCREENING SYSTEMS  11-14
      1.2.1 Viability Assays  11-13
      1.2.2 Cytotoxicity Assays  13-14
    1.3 THE GFP ASSAY  14-17
      1.3.1 Green Fluorescent Protein  14-15
      1.3.2 GFP Assay  15-16
      1.3.3 GFP and Drug Screening  16-17
    1.4 THE NEW GREEN FLUORESCENCE PROTEIN ASSAY  17-18
      1.4.1 Principle  17
      1.4.2 Features of New GFP Assay  17-18
  MATERIALS AND METHODS  18-22
    2.1 MATERIALS REQUIRED  18-19
      2.1.1 Cell lines  18
      2.1.2 Media, Solutions and Reagents  18
      2.1.3 Apparatus and Equipment  18-19
    2.2 METHODS AND PROTOCOLS  19-22
      2.2.1 Production of stable UGFP‐DK1 cell line  19
      2.2.2 MTT Assay  19
      2.2.3 Fluorescence Assay  19-21
      2.2.4 IC50 Determination  21-22
  RESULTS AND DISCUSSIONS  22-30
    3.1 DEVELOPMENT OF UGFP‐DK1 CELL LINE  22-23
    3.2 GROWTH CURVES USING THE GREEN FLUORESCENCE PROTEIN (GFP) ASSAY  23-24
    3.3 THE GFP ASSAY’S RESPONSE TO ANTICANCER DRUG  24-25
    3.4 OPTIMIZATION OF THE GFP ASSAY  25-26
    3.5 RELIABILITY OF THE GFP ASSAY  26-28
    3.6 SENSITIVITY OF THE GFP ASSAY  28-29
    3.7 IC50 DETERMINATION  29-30
  CONCLUSION  30-31
PART B: USING UGFP‐DK1 ASSAY TO FACILITATE THE DISCOVERY OF A NOVEL SERM WITH ANTICANCER ACTIVITIES THAT ACTS THROUGH HTERT  31-69
  INTRODUCTION  32-42
    5.1 CANCER DRUG  32-36
      5.1.1 Research and Development  32-33
      5.1.2 Hallmarks of Cancer  33-34
      5.1.3 New Mechanistic Approach for Drug Development  34-36
    5.2 SERMS  36-39
      5.2.1 What are SERMs?  36-37
      5.2.2 MECHANISM OF ACTION  37-39
    5.3 COMPOUND 11  39-40
      5.3.1 Structure and Properties  39
      5.3.2 Compound 11 as a SERM  39-40
    5.4 HTERT  40-42
      5.4.1 Telomere and Telomerase  40
      5.4.2 hTERT and Cancer  40-42
  MATERIALS AND METHODS  42-51
    6.1 MATERIALS REQUIRED  42-45
      6.1.1 Cell lines  42
      6.1.2 Reagents and Buffers  42-45
    6.2 METHODOLOGY  45-51
      6.2.1 Morphology Studies  45
      6.2.2 Apoptosis Studies by PI and DAPI Staining  45
      6.2.3 Luciferase Assay  45-46
      6.2.4 Western Blot  46-47
      6.2.5 Immunofluorescence  47-48
      6.2.6 Cell Cycle Analysis by DNA content (PI) using Flow Cytometry  48-49
      6.2.7 In vivo Study  49-51
  RESULTS AND DISCUSSIONS  51-67
    7.1 SCREENING OF SERMS USING FLUORESCENCE ASSAY  51-52
    7.2 MORPHOLOGICAL STUDIES  52-55
    7.3 CELL CYCLE ANALYSIS  55-58
    7.4 MECHANISM OF ACTION OF COMPOUND 11  58-63
      7.4.1 PROLIFERATION RESPONSE TO ESTRADIOL BY SKOV3 AND MCF7 CELL LINES  58
      7.4.2 Compound 11 is a Modulator of ERE and GRE  58-60
      7.4.3 Identification of various pathways influenced by Compound 11  60-62
      7.4.4 COMPOUND 11 CHANGES THE HTERT PROTEIN EXPRESSION  62-63
    7.5 IMMUNOFLUORESCENCE  63-64
    7.6 ANIMAL MODEL STUDY  64-67
  CONCLUSION  67-69
REFERENCES  69-76
ACKNOWLEDGEMENTS  76-78

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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