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IRAS基因敲除小鼠的构建及相互作用蛋白的筛选

作　者: 张岭
导　师: 李锦
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: I1咪唑啉受体条件性基因敲除表型分析蛋白相互作用 SERTAD1
分类号: R965
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

上世纪80年代Bousquet最早提出了咪唑啉受体的概念。此后研究者们采用药理学和分子生物学等技术对该受体的结构和功能进行了深入的研究。首先，研究者采用药理学技术将该受体与经典2-肾上腺素受体相区别，并在此基础上将该受体分为多种亚型，发现I1咪唑啉受体参与了中枢血压调节、药物依赖、肾脏排钠利尿、胃酸分泌以及胰岛素分泌等过程；然而，由于在前期研究工作中没有选择性I1咪唑啉受体阻断剂，使得针对I1咪唑啉受体功能的深入研究受到了极大限制。其后，研究者采用分子生物学技术针对I1咪唑啉受体开展了大量研究工作。Piletz用咪唑啉受体抗血清从人的海马cDNA文库中克隆得到了I1咪唑啉受体候选蛋白（IRAS），但目前仍缺乏直接的实验证据证实IRAS就是I1咪唑啉受体，也没有有效的整体动物模型用于评价IRAS在血压调节、激素分泌及药物依赖等生理及病理生理过程中的意义。此外在前期的研究中，IRAS一方面存在多种潜在的剪接异构体，另一方面参与多种生理功能，例如抑制细胞迁移、抗凋亡以及调节阿片系统功能等等，然而有关上述多种剪接异构体与IRAS功能之间的关系尚有待深入研究。基于上述研究工作基础，我们本次工作的主要内容就是构建IRAS条件性基因敲除小鼠，为I1咪唑啉受体/IRAS蛋白的功能研究提供整体水平上的高选择性研究模型；同时本课题计划采用酵母双杂交方法筛选与不同的IRAS片段相互作用的蛋白，试图在分子水平为研究IRAS蛋白的功能提供有益的线索。一、IRAS基因敲除小鼠的构建及初步表型筛选首先针对小鼠IRAS蛋白编码基因进行分析，发现可操作外显子为第4和第5外显子，因此构建了分别锚定两个外显子的两个打靶载体。由于第5外显子与第6外显子相距较近，为了尽量减少对基因组结构的影响，在构建打靶载体1时将这两个外显子放在一起进行操作；长臂放在了锚定序列的上游，这样除第4外显子外序列均为内含子，避免了对基因组结构的影响；将短臂放在下游，含7、8、9外显子。根据骨架载体的特点将长臂置于neo基因上游，将锚定序列和短臂置于neo基因下游，并在中间插入了loxP序列。针对该打靶载体，长片段PCR上游引物来自锚定序列和短臂之间（loxP序列），下游引物定位在短臂外侧。此外，利用5’southern blot进行筛选时使用SpeI酶切，野生带11kb，重组带7kb；3’southern blot用EcoRI酶切，野生带21kb，重组带为14kb。打靶载体构建成功后，经酶切和测序验证外显子和loxP序列正确。线性化处理后电转小鼠ES细胞，正负加压培养。将打靶载体1电转小鼠ES细胞后共获得304个ES细胞克隆，loxP阳性208个，但长片段PCR和southern blot筛选均未发现同源重组克隆。打靶载体2主要锚定第4外显子，同样长臂包含在上游内含子内，短臂在下游涵盖第5、6外显子。根据骨架载体特点将长臂和锚定序列置于neo基因上游，中间插入loxP序列，短臂则放在了neo基因下游。长片段PCR上游引物在neo基因的3’端，下游引物则在短臂的外侧。将打靶载体2电转小鼠ES细胞后共获得366个ES细胞克隆，loxP阳性268个，经长片段PCR筛选最终得到阳性ES细胞克隆三个（2-11B、1-10A、2-3D），其中2-11B囊胚注射后得到嵌合体小鼠，与C57小鼠交配获得重组杂合子小鼠。之后用C57小鼠进行扩增，得到稳定的基因型，再与EII-cre小鼠进行交配，得到IRAS完全敲除的小鼠。同时，将重组小鼠与flp小鼠杂交，可特异性剔除基因组中neo序列（两端有FRT序列），得到IRAS基因被两个loxP锚定（floxed）的小鼠，可用于进一步的条件性基因敲除小鼠的制备。得到上述重组杂合子小鼠、敲除小鼠以及floxed小鼠后对其进行鉴定。针对重组杂合型小鼠在基因组水平进行鉴定，采用ES细胞筛选时用到的loxP两端引物对重组杂合子小鼠基因组进行PCR扩增，结果产物中除了重组带和野生带以外出现比重组带大的第三条带，实验证实它是重组片段和野生片段退火形成的，参考实际的测序结果，推测其是一条重组片段单链和两条野生片段单链退火形成的产物。针对floxed小鼠在下游loxP的前后设计引物，结果野生带和重组带大小均正确。针对敲除小鼠在基因组水平和mRNA水平进行鉴定，采用ES细胞筛选时用到的loxP正向引物以及floxed小鼠鉴定时用到的反向引物对敲除小鼠基因组进行PCR可获得特异性敲除带，再用ES细胞筛选时用到的长片段引物进行PCR扩增，产物测序结果与设计的相同。另外，提取敲除小鼠肝脏总RNA，反转录后进行real-time PCR，结果显示，以第3和第5外显子上的引物进行扩增得到正常的扩增曲线，但PCR产物的长度缩短，而以第2和第4外显子上的引物进行扩增，未能得到扩增曲线，说明mRNA转录正常，但成熟的mRNA缺少第4外显子，并且以此进行分析，在之后的第5外显子中会出现终止密码子。取野生型和敲除型动物的小脑提取蛋白进行western blot检测，结果发现针对IRAS的N末端的抗体在130kD附近发现一条差异条带，针对C末端的抗体在95至130kD之间检测到3条差异条带，该结果提示小鼠IRAS蛋白有可能是以某种剪切异构体形式存在的。获得足够量的完全敲除和野生型动物后，我们对敲除动物的表型进行了初步分析。结果如下：1.生殖方面，杂合型动物在形成配子时，野生型配子和敲除型配子的比例没有明显区别。2.发育方面，出生后第3周、第7周和第11周，野生型动物的体重明显高于敲除型动物。并且这种体重差异在断乳前就已存在，进一步取第15天和第12天的胚胎进行观察，发现敲除型动物的发育迟缓开始于胚胎期。3.敲除型动物出生后易发生死亡。尸检观察动物存在严重感染，已形成大叶性肺炎。4.敲除型动物的摄食量明显低于野生型动物。但两种基因型动物的体温没有差别。5. IRAS基因敲除后动物空腹血糖升高，且口服糖耐量明显低于野生型动物，说明IRAS基因可能参与血糖的代谢。6.自发活动实验中，中心区停留时间结果敲除型动物高于野生型。但开场实验各项指标野生型和敲除型动物没有区别7.抓力和转棒实验结果显示两种基因型动物的神经运动功能没有区别8.水迷宫实验结果显示两种动物的学习记忆能力没有区别。9.前脉冲抑制试验中两种动物的结果没显著区别，说明IRAS基因参与精神分裂症的可能性不大。10.悬尾和强迫游泳实验结果显示敲除型动物的不动时间缩短，说明IRAS基因敲除后动物情绪可能受到影响。11.热板和甩尾实验结果显示敲除型动物的基础痛阈低于野生型动物，说明IRAS基因可能参与痛觉的形成过程。12.阿片类物质作用方面，吗啡及美沙酮对敲除动物的镇痛作用明显弱于相同剂量药物对野生型的作用。长期给药后敲除型动物更容易形成耐受。纳洛酮催促实验中敲除型动物出现跳跃的比例明显高于野生型。这些结果与本实验室前期发现的胍丁胺对阿片系统功能的调节作用相一致，初步提示IRAS是胍丁胺发挥―阿片系统双向调节剂‖作用的物质基础。基于以上研究工作，我们通过构建打靶载体，得到了三株重组阳性的小鼠胚胎干细胞，而后获得重组杂合型小鼠，并获得全身敲除小鼠和floxed小鼠，全身敲除小鼠的表型有以下四个方面：发育迟缓、血糖升高、痛阈降低同时对吗啡的反应出现双向变化，动物抑郁样情绪发生变化。二、相互作用蛋白的筛选及鉴定在酵母双杂交实验中，首先采用生物信息学研究方法，针对IRAS蛋白不同的功能结构域将其分成六段，选择其中五段作为诱饵，在人胚胎脑表达文库中筛选与IRAS发生相互作用的蛋白，结果获得3个阳性克隆。以IRAS621-870氨基酸为诱饵筛选得到SERTAD1的全序列，NCBI gene ID:29950，主要功能为细胞周期调节、促进增殖以及抗细胞凋亡作用；以IRAS431~620氨基酸为诱饵筛选得到SORL1的羧基端1700aa之后的多肽，NCBI gene ID:6653，与老年痴呆发病有关，主要功能为参与淀粉样蛋白的胞内转运；以IRAS621-870氨基酸为诱饵筛选得到USP11羧基端654aa之后的多肽，NCBI gene ID:8237，是一种去泛素化酶。在此基础上以SERTAD1为对象我们进行蛋白间相互作用的验证。首先在酵母双杂交回转验证和免疫共沉淀试验中，诱饵片段（IRAS621-870aa）与SERTAD1存在相互作用；进一步采用免疫共沉淀实验证实全长IRAS与SERTAD1存在相互作用。采用荧光共振能量转移实验发现，IRAS与SERTAD1之间的FRET值在0.16左右，表明二者间的相互作用较弱，但不能排除是由于IRAS分子量过大造成一定的空间位阻而影响荧光能量的转移。在上述研究基础上，我们用免疫共沉淀的方法观察I1咪唑啉受体激动剂莫索尼定和胍丁胺对两种蛋白间相互作用的影响，结果发现上述药物并不能增强或减弱两种蛋白间的相互作用。为了确定两种蛋白间发生相互作用的具体肽段，我们还采用免疫共沉淀的方法发现SERTAD1还能与IRAS蛋白的潜在剪接体（512-1504）发生相互作用，而不能与潜在剪接体（1152-1504）发生相互作用。进一步采用哺乳动物双杂交的研究方法，我们确定了IRAS蛋白序列中与SERTAD1发生相互作用的是（621-700aa）肽段，即预测的卷曲螺旋区。由于SERTAD1与肿瘤发生密切相关，因此人们将其定义为癌基因的一种。基于此，我们找到了与两蛋白间相互作用有关的IRAS内部特异性片段，为下一步研究IRAS在肿瘤方面的相关功能奠定了基础。基于第二部分研究工作，我们采用酵母双杂交方法发现了三个与IRAS蛋白发生相互作用的生理性肽段，并对其中SERTAD1与IRAS的相互作用进行了全面系统的验证，为进一步研究IRAS在肿瘤发生过程中的作用奠定了基础。总之，本项工作构建了IRAS条件性基因敲除小鼠，为I1咪唑啉受体的研究提供了整体水平上的经典动物模型。同时在敲除动物上发现了与药物依赖、发育、糖尿病、抑郁症相关的表型。另外在蛋白相互作用筛选中我们发现了IRAS可以与SERTAD1发生相互作用，为IRAS在肿瘤方面的研究提供了线索。

全文目录

缩略词表  5-6
摘要  6-11
Abstract  11-15
前言  15-20
  1. 咪唑啉受体相关研究  15-16
  2. IRAS 蛋白的发现及其结构和功能研究  16-18
  3. 本课题的研究内容  18-20
第一部分 IRAS 基因敲除小鼠的构建及初步表型分析  20-78
  1. 打靶策略  20-22
  2. 打靶载体 I 的构建及胚胎干细胞的筛选  22-40
    2.1. 材料方法  22-23
    2.2. 打靶载体 1 的设计及胚胎干细胞筛选策略  23-26
    2.3. 打靶质粒的构建及 ES 细胞的筛选  26-40
  3. 打靶载体 II 的构建及胚胎干细胞的筛选  40-49
    3.1. 打靶载体 II 的设计及胚胎干细胞筛选策略  40-42
    3.2. 打靶质粒的构建及 ES 细胞的筛选  42-49
  4. 各基因型小鼠的获得和鉴定  49-54
    4.1. 重组杂合子小鼠的获得和鉴定  49-50
    4.2. Floxed 小鼠的获得和鉴定  50-51
    4.3. 完全敲除小鼠的获得和鉴定  51-54
  5. 初步表型分析  54-69
    5.1. 生殖发育和动物一般生理指标  54-61
      5.1.1. 生殖能力  54-55
      5.1.2. 动物发育方面  55-59
      5.1.3. 死亡  59-60
      5.1.4. 摄食量  60
      5.1.5. 基础血糖和糖耐量测定  60
      5.1.6. 体温  60-61
    5.2. 神经和精神行为  61-69
      5.2.1. 一般行为方面  61-62
      5.2.2. 运动能力方面  62
      5.2.3. 动物基础痛阈  62-64
      5.2.4. 学习记忆能力  64-65
      5.2.5. 焦虑抑郁方面表型  65-66
      5.2.6. 精神分裂症方面的表现  66-67
      5.2.7. 吗啡镇痛和躯体依赖  67-69
  6. 讨论  69-78
    6.1. 基因打靶及打靶效率  69-70
    6.2. 完全敲除小鼠的鉴定  70-71
    6.3. IRAS 与疼痛及吗啡镇痛  71-73
    6.4. IRAS 与生长发育  73-76
    6.5. IRAS 与抑郁  76-78
第二部分相互作用蛋白的筛选  78-95
  1. 材料方法  78-83
    1.1. 质粒构建  78-79
    1.2. 酵母双杂交  79-81
      1.2.1. 试剂  79-80
      1.2.2. 酵母双杂交的基本流程  80
      1.2.3. 酵母转化流程  80-81
      1.2.4. 文库筛选  81
      1.2.5. 自激活鉴定  81
    1.3. 免疫共沉淀  81-82
      1.3.1. 试剂材料  81-82
      1.3.2. 免疫共沉淀步骤  82
    1.4. 荧光能量共振转移（FRET）  82
    1.5. 哺乳动物双杂交  82-83
      1.5.1. 试剂仪器  82-83
      1.5.2. 操作步骤  83
  2. 结果  83-91
    2.1. 相互作用蛋白的筛选  83-85
    2.2. 蛋白相互作用的验证  85-91
      2.2.1. IBD 与 SERTAD1 的相互作用验证  85-86
      2.2.2. IRAS 与 SERTAD1 相互作用的验证  86-89
      2.2.3. IRAS 与 SERTAD1 相互作用部位的寻找  89-91
  3. 讨论  91-95
结论  95-96
参考文献  96-104
综述  104-112
  参考文献  109-112
在读期间发表文章  112-118
个人简历  118-119
致谢  119

IRAS基因敲除小鼠的构建及相互作用蛋白的筛选

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