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禾谷镰刀菌丝/苏氨酸蛋白激酶SCH9基因的功能研究

作　者: 王玉林
导　师: 许金荣
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 禾谷镰刀菌 Sch9 激酶表型分析功能验证小麦赤霉病
分类号: S432.44
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)是一类重要的植物病原真菌,有关禾谷镰刀菌的研究一直是国内外的一个热点。禾谷镰刀菌能引起多种作物发病造成经济损失,并且能够产生多种单端孢霉烯族毒素( Trichothecenes)可使人、畜中毒,严重影响了小麦的品质及商业价值。自2003年禾谷镰刀菌野生型菌株PH-1的全基因组序列公布以来,其功能基因组学研究发展迅速,各种研究基因功能的方法被广泛用于禾谷镰刀菌的研究,其中基于遗传转化的体内同源重组的基因敲除技术在禾谷镰刀菌基因功能研究方面表现出优越性。禾谷镰刀菌PH-1菌株基因组大小为36.1 Mb,分布在4条染色体上。其中,激酶是一类从高能供体分子(如ATP)转移磷酸基团到特定靶分子(底物)的酶,这一过程谓之磷酸化。生物体内普遍存在的信息转导调节方式是蛋白激酶(protein kinase,pk)和蛋白磷酸酶(protein phosphatase)催化蛋白质磷酸化与去磷酸化,这一过程几乎涉及所有的生理过程。目前赤霉菌中预测的蛋白激酶基因约有120多个。Sch9作为蛋白激酶基因之一发挥着重要的作用。Sch9是酵母中TORC1的底物, AGC型蛋白激酶Sch9 C末端的六个氨基酸能够直接被TORC1磷酸化,而在雷帕霉素处理、碳氮饥饿、短暂的渗透胁迫、氧化胁迫和热胁迫下,Sch9发生去磷酸化,通过磷酸化和去磷酸化,Sch9能够调节核蛋白体的产生,翻译起始,细胞G0期的进入等过程。本研究借助潮霉素抗性基因hph,通过Split PCR,采用PEG介导的原生质体转化方法,对转化子进行PCR检测和southern验证,获得了禾谷镰刀菌sch9缺失突变体。我们对该突变体进行了系统的生物学研究,包括菌落形态观察、生长速度测量,分生孢子形态观察、产孢量统计,孢子萌发观察,胡萝卜培养基有性杂交, H2O2等4种压力筛选下的表型变化以及接种小麦穗和玉米秆、玉米须的侵染试验以及接种后小麦籽粒的产毒能力,。结果表明,突变体菌落气生菌丝较疏,生长速率下降,孢子形态没有改变但产孢量下降,孢子萌发的菌丝变短,在胡萝卜培养基上突变体能通过有性生殖产生正常的子囊和子囊孢子,在压力筛选下突变体表现出明显的不耐压。对小麦品种小偃22和玉米杆、玉米须的致病性明显下降,而且籽粒毒素含量也明显下降。推测Sch9是赤霉菌正常生长代谢所必需的基因,与致病性,抗逆能力有关。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-12
第一章文献综述  12-21
  1.1 禾谷镰刀菌概况  12-16
    1.1.1 小麦赤霉病概述  12-14
    1.1.2 禾谷镰刀菌的基本生物学特性  14
    1.1.3 禾谷镰刀菌基因功能研究概述  14-16
  1.2 真菌遗传转化方法概述  16-17
    1.2.1 原生质体-PEG 介导的转化  16
    1.2.2 农杆菌介导法  16
    1.2.3 基因沉默  16
    1.2.4 转座子插入突变法  16-17
    1.2.5 限制酶介导的转化  17
    1.2.6 电击转化法  17
    1.2.7 醋酸锂转化法  17
    1.2.8 脂质体转化法  17
  1.3 Sch9 研究进展  17-20
    1.3.1 激酶基因概述  17-18
    1.3.2 Sch9 研究概述  18-20
  1.4 本研究的目的意义和技术路线  20-21
第二章禾谷镰刀菌Sch9 基因敲除转化子的获得及突变体的筛选和验证  21-36
  2.1 前言  21
  2.2 材料、试剂、仪器及培养基  21-22
    2.2.1 材料  21
    2.2.2 试剂、耗材及仪器  21
    2.2.3 培养基及主要试剂配方  21-22
  2.3 实验方法  22-31
    2.3.1 禾谷镰刀菌Sch9 基因核酸序列下载  22-23
    2.3.2 侧翼序列扩增引物和检测引物的设计  23
    2.3.3 禾谷镰刀菌的培养  23
    2.3.4 CTAB 法提取基因组DNA  23-24
    2.3.5 大肠杆菌 DH10B 感受态的制备  24
    2.3.6 质粒 pCB1003 的电击转化  24-25
    2.3.7 质粒 pCB1003 的提取  25
    2.3.8 重叠PCR(split PCR)  25-27
    2.3.9 琼脂糖凝胶DNA 回收  27
    2.3.10 PCR 产物浓缩  27
    2.3.11 原生质体制备及PGE 介导的转化  27-28
    2.3.12 快速提取转化子DNA  28
    2.3.13 PCR 检测转化子  28-29
    2.3.14 Southern blot 验证突变体  29-31
    2.3.15 突变体的保存  31
  2.4 实验结果与分析  31-34
    2.4.1 引物设计  31-33
    2.4.2 获得的转化子  33-34
    2.4.3 Southern blot 验证结果  34
  2.5 讨论  34-36
第三章突变体Sch9 的生物学特征观察以及致病性测试  36-43
  3.1 前言  36
  3.2 材料、器材及培养基  36
  3.3 实验方法  36-38
    3.3.1 突变体菌株的形态观察  36
    3.3.2 突变体的分生孢子数目统计和形态观察  36-37
    3.3.3 突变体菌丝形态观察  37
    3.3.4 Sch9 基因缺失突变体有性生殖试验  37
    3.3.5 Sch9 基因缺失突变体接种小麦穗的致病性实验  37
    3.3.6 Sch9 基因缺失突变体接种玉米的致病性实验  37-38
    3.3.7 Sch9 基因缺失突变体在不同平板上的压力筛选  38
  3.4 实验结果与分析  38-42
    3.4.1 突变体菌落形态及生长速度  38-39
    3.4.2 突变体孢子形态和产孢量  39
    3.4.3 Sch9 基因缺失突变体菌丝形态  39-40
    3.4.4 Sch9 基因缺失突变体在胡萝卜培养基上的有性生殖实验  40
    3.4.5 Sch9 基因缺失突变体接种小麦穗的致病性实验  40-41
    3.4.6 Sch9 基因缺失突变体接种玉米的致病性实验  41-42
    3.4.7 Sch9 基因缺失突变体在四中选择压力条件下的生长情况  42
  3.5 讨论  42-43
第四章结论  43-44
参考文献  44-48
致谢  48-49
作者简介  49

禾谷镰刀菌丝/苏氨酸蛋白激酶SCH9基因的功能研究

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