学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

EPC在DR发病及治疗中作用的实验研究

作　者: 张惟
导　师: 颜华
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 糖尿病视网膜病变内皮祖细胞细胞培养辛伐他汀动物实验
分类号: R774.1
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 5次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的：本研究通过建立Wistar大鼠糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)模型并检测骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPC)的数量及功能变化,探讨EPC在DR发病机制中的作用：进而应用辛伐他汀动员大鼠DR模型体内EPC,观察其对大鼠DR模型视网膜病变的修复作用及机制。方法：(1)雄性Wistar大鼠50只,随机分为正常对照(CON)组(14只鼠)和糖尿病(DM)组(36只鼠)。通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立DR模型,根据病程,将DM组大鼠再分为糖尿病1个月(DM1)组、糖尿病3个月(DM3)组、糖尿病6个月(DM6)组,每组各12只。同时于各相应时间点摘除大鼠眼球行苏木精-伊红(HE)染色,采用免疫组织化学法分析血管内皮生长因子(VEGF)在大鼠视网膜中的表达,透射电子显微镜进行视网膜病理组织学检查。(2)根据前一部分DR大鼠模型,采用密度梯度离心法从各组大鼠骨髓获取单个核细胞,将其接种于纤维连接蛋白包被的培养板；培养7d后,利用Dil-acLDL和FITC-UEA-I细胞荧光染色法及流式细胞仪CD34和CD133抗体标记法鉴定EPC。在倒置相差显微镜下对EPC计数克隆形成单位(CFU),以评估骨髓EPC的数量水平；采用MTT比色法、Transwell小室和粘附能力测定实验观察EPC的增殖、迁移和粘附能力。(3)雄性Wistar大鼠80只,以随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、安慰剂组、辛伐他汀组,每组各20只大鼠。实验组采用腹腔注射STZ建立DR大鼠模型。正常对照组、模型对照组不给予任何干预；辛伐他汀组予辛伐他汀20mg/kg灌胃,1次/d；安慰剂组给予等量蒸馏水灌胃,1次/d。分别于1、4及12周时取静脉血,采用流式细胞仪分别计数各组大鼠外周血EPC数量的变化。于12周时处死大鼠,摘除眼球行HE染色,采用伊文思蓝(EB)定量检测血-视网膜屏障(BRB)的破坏程度,免疫组织化学法分析CD31在大鼠视网膜中的表达及透射电子显微镜进行视网膜病理组织学检查。实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及血管生成素-1(Ang-1)在视网膜的表达。对比分析EPC的数量改变与视网膜病理变化的相互关系。结果：(1)DM大鼠血糖明显升高,体重明显下降。DM1、DM3组视网膜视网膜厚度变薄,细胞排列紊乱,细胞核肿胀、体积增大,DM6组视网膜厚度更薄,细胞排列紊乱更加明显,部分血管扩张。DM1、DM3、DM6组视网膜VEGF表达较CON组明显增高,差异均有统计学意义。DM1组毛细血管内皮细胞及周细胞核膜轻微凹陷,异染色质聚集靠边。DM3组内皮细胞水肿,毛细血管基底膜增厚,电子密度明显增大。DM6组内皮细胞肿胀变形,基底膜增厚显著,管腔明显狭窄,甚至闭塞。(2)DM1、DM3、DM6组大鼠骨髓来源EPC-CFU数量、EPC增殖能力、迁移能力及粘附能力较CON组降低,差异均有统计学意义。(3)注射STZ后1、4、12周时安慰剂组大鼠外周血EPC计数均降低；注射STZ后1、4、12周时辛伐他汀组大鼠外周血EPC计数明显高于模型对照组和安慰剂组,差异均有统计学意义。模型对照组和安慰剂组大鼠视网膜细胞排列紊乱,内皮细胞水肿,基底膜增厚显著,电子密度增加,周细胞线粒体肿胀,嵴消失；辛伐他汀组大鼠视网膜各层组织水肿减轻,内皮细胞及周细胞核膜轻微凹陷,异染色质聚集靠边,管腔未变形。模型对照组和辛伐他汀组大鼠视网膜平均EB渗漏量较正常对照组显著增加,辛伐他汀组较模型对照组明显减少；CD31在正常对照组表达为弱阳性,辛伐他汀组表达强度较模型对照组增强；eNOS在模型对照组表达较正常对照组明显减弱,辛伐他汀组表达强度较模型对照组增强；iNOS和Ang-1在模型对照组表达较正常对照组明显增强,辛伐他汀组表达强度较模型对照组减弱,差异均有统计学意义。结论：(1)糖尿病大鼠骨髓EPC数量较正常大鼠降低,生物学功能减退。随着DR的进展,EPC数量逐渐回升。(2)辛伐他汀可动员DR大鼠外周血EPC,诱导视网膜内皮细胞迁徙分化,减缓DR进展,其可能机制为调节eNOS和iNOS等内皮形成相关因子。

EPC在DR发病及治疗中作用的实验研究

内容摘要

全文目录

相似论文