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可诱导型乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠模型的构建

作　者: 王芊艺
导　师: 周涛；梁冰
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: Tet-on系统 CUEDC2 转基因小鼠
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

CUEDC2(CUE domain containing protein 2)是含有CUE结构域的蛋白质。CUE结构域是一个大约含有40个氨基酸的保守序列,能识别细胞内的单泛素和多泛素。在本实验室的前期工作中,发现CUEDC2能够促进孕激素受体(PR)的泛素化降解,抑制PR的转录活性,进而抑制孕激素依赖的乳腺癌细胞的生长(The EMBO Journal,2007)。在后续的工作中,发现CUEDC2能够与NF-κB通路的激酶IKK结合,并将磷酸酶复合物GADD34/PP1招募到IKK复合物上,使IKK灭活,进而达到抑制NF-κB通路激活的作用(Nature Immunology,2008)。本实验室在最近的研究中,通过对449例乳腺癌临床标本分析发现,CUEDC2在乳腺癌中高表达,并可作为分子标志物进行乳腺癌内分泌治疗的预后判断(Nature Medicine,2011)。Tet-on/Tet-off四环素诱导表达系统是目前比较成熟的真核生物基因诱导表达系统之一,在细胞水平和转基因动物中广泛应用。该诱导表达系统高效、无毒,能够在时间上控制目的基因的表达,这对认识基因在生长发育、生理活动及病理过程中的作用有重要意义。为了更好地研究CUEDC2的功能,本研究引入Tet-on四环素基因诱导表达系统来构建乳腺特异表达CUEDC2的转基因小鼠。在诱导物四环素(doxycycline)的作用下,rtTA调控元件和四环素相应元件TRE特异结合,启动下游目的基因的表达,在无诱导物时则不能启动下游基因的转录。我们首先构建了CUEDC2转基因表达载体,并在乳腺癌细胞MCF7中验证表达。转基因表达载体经酶切,得到含有CUEDC2的线性DNA片段。显微注射至小鼠受精卵原核,经筛选鉴定出CUEDC2阳性转基因小鼠。与乳腺组织特异表达rtTA的转基因小鼠交配后,产生CUEDC2/rtTA双阳性转基因小鼠。持续给予2mg/ml的四环素(Doxycycline)诱导小鼠在乳腺组织内特异表达CUEDC2,并通过蛋白印迹(Western Blot)、免疫组化(immunohistochemistry)等方法进行表达检测。我们的实验结果表明,乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠构建成功,这将为今后深入研究CUEDC2在乳腺癌发生发展中的作用提供前提和基础,进一步的研究有可能揭示乳腺癌发生中的重要分子事件,并为乳腺癌治疗提供新的靶标。

可诱导型乳腺特异表达CUEDC2转基因小鼠模型的构建

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