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iASPP在MCF7细胞及C57小鼠胸腺细胞抵抗凋亡中的作用

作　者: 王琳
导　师: 庞天翔
学　校: 北京协和医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: ASPP家族 iASPPsv MCF7 单克隆 凋亡 Real time PCR H2AX iASPP 转基因小鼠 胸腺细胞
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究目的:iASPP是p53凋亡促进蛋白家族(apoptosis stimulating protein of p53, ASPP)的抑制性成员(inhibitory member of ASPP of p53family, iASPP),能够特异性抑制p53的促凋亡活性。iASPPsv是本实验室发现的iASPP短型剪接体,全长407氨基酸,和828氨基酸的iASPP在C端高度同源。研究显示iASPPsv能够抑制p53蛋白对Bax基因启动子的转录。我们构建了稳定表达iASPPsv的人类乳腺癌细胞株,研究了iASPPsv高表达细胞生物学功能及对化疗药物敏感性的改变。研究方法：构建慢病毒载体pCDH-iASPPsv,感染人类乳腺癌细胞系MCF7,经有限稀释法筛选得到表达iASPPsv的MCF7单克隆和感染pCDH的MCF7单克隆。经VP-16处理后,用MTT法检测细胞的生长抑制率,用流式细胞术检测细胞的凋亡水平,用Real time PCR检测凋亡基因Bax、PUMA、Noxa的mRNA表达水平,Western blot方法检测组蛋白H2AX的水平。结果：(1)经慢病毒感染和有限稀释法筛选后,得到3个表达iASPPsv的MCF7单克隆,经Western blot检测,证实其iASPPsv的蛋白表达水平高于感染pCDH的MCF7。(2)对iASPPsv在化疗药物VP-16抑制细胞生长中的作用研究发现,细胞经不同浓度VP-16处理24h、48h后,表达iASPPsv的MCF7的生长抑制率显著低于感染pCDH的MCF7。(3)对iASPPsv在化疗药物VP-16诱导细胞凋亡中的作用研究发现,经200μg/mL VP-16处理24h、48h后,表达iASPPsv的MCF7的凋亡水平显著低于感染pCDH的MCF7。(4)进一步对其分子机制的研究发现,经200μg/mLVP-16处理24h、48h后,表达iASPPsv的MCF7中凋亡基因Bax、PUMA和Noxa的mRNA水平显著低于感染pCDH的MCF7。(5)为确定iASPPsv对于药物处理后的细胞中DNA损伤水平的影响,进一步检测药物处理后H2AX的水平,结果显示经200μg/mL VP-16处理24h后,表达iASPPsv的MCF7中H2AX水平高于感染pCDH的MCF7。结论：iASPPsv能够抵抗VP-16对MCF7的生长抑制作用,抑制促凋亡基因Bax、 PUMA、Noxa的转录和细胞凋亡。iASPPsv可能通过抑制p53相关的凋亡途径降低了细胞对化疗药物的敏感性,但细胞中的DNA双链断裂损伤仍然存在并累积,从而导致恶性肿瘤的发生。研究目的：iASPP是p53结合蛋白ASPP家族中的一员,能够抑制p53对促凋亡蛋白转录子的转录作用,从而抑制p53诱导的凋亡的水平。我们已证实iASPsv能够减弱VP-16对乳腺癌细胞系MCF7产生的增殖抑制作用,能够减弱经VP-16处理后MCF7中促凋亡基因Bax、PUMA和Noxa的表达水平,进而减弱细胞的凋亡水平,但同时,使细胞中H2AX蛋白的水平升高,显示了细胞中存在更多的DNA双链损伤。为了进一步研究iASPP/iASPPsv在正常细胞中的作用,我们实验室构建了iASPP/iASPPsv转基因小鼠。我们用Dex或VP-16处理iASPP/iASPPsv转基因小鼠胸腺细胞,研究iASPP/iASPPsv拮抗化疗药物诱导凋亡的作用。研究方法：取野生C57小鼠和iASPP转基因小鼠的胸腺,经小鼠淋巴液分离得到小鼠胸腺细胞。经VP-16或Dex处理后,用MTT法检测细胞的生长抑制率,用流式细胞术检测细胞的凋亡水平,用Westrn blot检测组蛋白H2AX的水平。结果：(1)经流式细胞术检测野生C57小鼠胸腺细胞和转基因小鼠胸腺细胞的表面抗原,结果显示,二者的分化程度没有显著不同,说明后续实验显示出的差异不是由于细胞分化程度不同引起的；(2)细胞经不同浓度VP-16或Dex处理48h后,转基因小鼠胸腺细胞的生长抑制率低于野生C57小鼠的；(3)经VP-16或Dex处理12h、24h、48h,转基因小鼠胸腺细胞的凋亡程度低于野生C57小鼠的；(4)经0.1μg/mlVP-16或者1nM Dex处理48h后,转基因小鼠胸腺细胞的H2AX含量高于野生C57小鼠胸腺细胞的H2AX水平。结论：iASPP能够抵抗Dex或VP-16对小鼠胸腺细胞的生长抑制；iASPP能够抑制Dex或VP-16处理后小鼠胸腺细胞的凋亡水平；iASPP的存在导致细胞群体中DNA损伤细胞的比例增加。

全文目录


第一部分 iASPPsv 的学位论文">iASPPsv在MCF7细胞抵抗凋亡中的作用  5-47
  中文摘要  6-7
  Abstract  7-8
  前言  8-10
  材料与方法  10-28
  结果  28-40
  讨论  40-44
  参考文献  44-47
第二部分 iASPP/iASPPsv在C57小鼠胸腺细胞抵抗凋亡中的作用  47-64
  中文摘要  48-49
  Abstract  49-50
  前言  50-52
  材料方法  52-59
  结果  59-63
  讨论  63-64
  参考文献  64
综述：p  64-66
53蛋白转录活性和转录选择性的影响因素  66-83
  参考文献  77-83
综述：Bax在内源凋亡途径中的作用  83-97
  参考文献  92-97
攻读学位期间发表的文章题录  97-98
缩略词表  98-99
致谢  99-101

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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