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CUEDC2的溶液结构及其与泛素相互作用的核磁共振研究

作　者: 崔佳梅
导　师: 颜贤忠
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药物分析
关键词: CUEDC2 蛋白质表达纯化核磁共振溶液结构
分类号: R917
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

CUEDC2是一个由287个氨基酸的、分子量约为32kDa的酸性蛋白质。研究发现CUEDC2能够和孕激素受体结合,促进孕激素诱导的受体的泛素化和降解过程,因此,可能作为一个新的肿瘤治疗靶点具有十分重要的应用价值。它的功能尚不明确,且正在进一步的研究中。根据生物信息学的分析结果表明CUEDC2含有CUE结构域。CUE结构域是一个含有40多个氨基酸且相对保守的泛素结合结构域,能够结合单泛素和多泛素。CUE结构域在结构上与UBA结构域十分相似,它们都是三个α螺旋,并且都是通过C端保守的疏水残基α1螺旋与泛素结合。为了进一步阐释CUEDC2结构与功能的关系,本论文初步探讨了CUEDC2与泛素体外相互作用的情况,确定了CUEDC2与泛素的相互作用位点。同时,对于CUEDC2的N端截断体的结构进行了初步探索。我们首先克隆并表达纯化了CUEDC2蛋白中包含CUE结构域的截断体CUEDC2(1-190),并对其进行15N和15N/13C同位素标记。利用SDS-PAGE、Tricine-PAGE对所纯化的蛋白进行鉴定。利用VARIAN 600MHz核磁共振仪采集了一系列三维核磁共振谱图,并使用NMRPipe,NMRView等软件归属了氨基酸主链原子的化学位移。通过生物学的蛋白体外结合实验,将CUEDC2的各个截断体蛋白与泛素蛋白进行生物体外的相互作用实验,利用考染与免疫印迹两种方法,我们观察了CUEDC2中不包含CUE结构域的截断体CUEDC2(1-133),CUE结构域CUEDC2(133-190),包含CUE结构域的CUEDC2(1-190)分别与泛素的体外相互结合情况。结果表明CUEDC2(133-190)和CUEDC2(1-190)与泛素有明显的相互作用,CUEDC2(1-133)与泛素没有相互作用。为了进一步明确包含CUE结构域的CUEDC2(1-190)与泛素的相互作用位点,以及发生相互作用过程中的关键的氨基酸残基,通过核磁共振的滴定实验,我们设定了一系列滴定比例,结合1H-15N HSQC谱图显示的滴定后的结果,进一步表明了CUEDC2(1-190)与泛素的结合。同时,结合氨基酸主链原子的化学位移指认结果确定了CUEDC2中与泛素在体外相互作用时的具体的结合位点。为了进一步研究CUEDC2的溶液结构,我们选择了从全长蛋白的N端开始,即从分子量相对较小的CUEDC2(1-133)蛋白开始进行结构研究。通过与相对较长的CUEDC2的截断体CUEDC2(1-190)的1H-15N HSQC谱进行比对,结果表明CUEDC2(1-133)的溶液结构与CUEDC2(1-190)的基本没有变化,进而推断此段结构对于进一步了解全长蛋白的结构是十分有意义的。我们采集了一系列三维核磁共振谱图HNCACB、CBCACONH、HNCO、HNCA、HNCOCA、HCCH-COSY和HCCHTOCSY、HBHACONH、CCCONH、15N-NOESY-HSQC和13C-NOESY-HSQC,并结合各种软件进行氨基酸主链原子和侧链原子的化学位移指认与结构计算。本论文研究了CUEDC2各个截断体与泛素的体外相互作用情况。通过分子克隆、表达纯化等方法制备并得到了蛋白CUEDC2(1-190)、泛素等蛋白。利用NMR数据对CUEDC2(1-190)的主链氨基酸原子的化学位移进行了归属,利用生物学实验与核磁共振滴定实验确定了CUEDC2(1-190)与泛素的相互作用及其相互作用的关键位点。通过CUEDC2(1-190)与CUEDC2(1-133)的1H-15N HSQC的比对,确定了CUEDC2(1-133)结构与全长蛋白的结构无差异。同时,对于通过化学位移归属已经得到的大部分的CUEDC2(1-133)的主链与侧链的归属结果,可以有助于进一步进行结构研究。

全文目录

缩写表  7-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章前言  12-24
  第一节核磁共振在研究蛋白质结构中的应用  12-18
    1.1.1 核磁共振技术的历史  12-13
    1.1.2 核磁共振技术对生物大分子溶液结构的测定  13-14
    1.1.3 核磁共振技术对生物大分子溶液结构的测定的基本流程  14-16
    1.1.4 核磁共振技术对蛋白与蛋白间相互作用的测定  16-18
  第二节 CUE 结构域与泛素  18-22
  第三节 CUEDC2 的研究背景  22-24
第二章 CUEDC2 溶液结构初步探索  24-33
  第一节核磁样品的制备和优化  24-29
    2.1.1 仪器和试剂  24
    2.1.2 CUEDC2(1-190) 核磁共振样品的准备  24-29
      2.1.2.1 CUEDC2(1-190) 重组质粒的构建  25
      2.1.2.2 融合蛋白质His-CUEDC2(1-190)的表达和纯化  25-27
      2.1.2.3 关于蛋白的稳定性实验  27
      2.1.2.4 核磁共振所用标记蛋白的表达和纯化  27-28
      2.1.2.5 核磁共振样品制备  28-29
  第二节 NMR 实验与化学位移归属  29-33
    2.2.1 CUEDC2(1-190) 的多维核磁共振实验  29
    2.2.2 谱图处理  29
    2.2.3 序列相关性化学位移归属  29-30
    2.2.4 His-CUEDC2(1-190)的一维1H 实验和1H-15N HSQC 实验结果  30-31
    2.2.5 化学位移归属结果  31-33
第三章 CUEDC2 各截段体与泛素的相互作用初步探索  33-48
  第一节 CUEDC2 各截断体与泛素蛋白的制备  33-37
    3.1.1 CUEDC2 各截断体的样品的制备  33-34
      3.1.1.1 CUEDC2(133-190)结构域的样品制备与鉴定  33-34
    3.1.2 泛素蛋白溶液的制备  34-37
      3.1.2.1 泛素的克隆、表达纯化  34-36
      3.1.2.2 泛素的鉴定  36-37
  第二节 CUEDC2 各截断体与泛素体外生物学的相互作用  37-42
    3.2.1 CUEDC2(1-190)与泛素的体外相互作用  37-38
    3.2.2 Tricine-SDS-PAGE 鉴定相互作用结果  38-39
    3.2.3 免疫共沉淀鉴定相互作用结果  39-42
  第三节 HSQC 谱监测CUEDC2(1-190)与泛素的相互作用  42-47
    3.3.1 NMR 二维1H-15N HSQC 谱监测CUEDC2(1-190)与Ub 的相互作用  42-47
      3.3.1.1 CUEDC2(1-190)与泛素的相互作用在二维谱中监测结果  42-45
      3.3.1.2 相互作用复合物的稳定性观察  45-47
  第四节本章小结  47-48
第四章 CUEDC2（1-133）初始结构的研究  48-59
  第一节蛋白质样品的制备  48-50
    4.1.1 CUEDC2(1-133) 的克隆、蛋白质的表达和纯化  48-50
      4.1.1.1 CUEDC2(1-133) 重组质粒的构建  48
      4.1.1.2 CUEDC2(1-133) 的克隆、蛋白质的表达和纯化  48-49
      4.1.1.3 CUEDC2(1-133) 13C、15N 标记蛋白的表达纯化  49-50
  第二节 CUEDC2(1-133)的多维核磁共振实验与化学位移归属  50-59
    3.2.1 CUEDC2(1-133) 的多维核磁共振实验  50
    3.2.2 CUEDC2(1-133) 与CUEDC2(1-190）二维1H-15N HSQC 谱图比对分析  50-51
    3.2.3 谱图处理  51-52
    3.2.4 序列相关性化学位移归属  52-54
    3.2.5 初始结构计算  54-59
      3.2.5.1 CUEDC2(1-133)的二级结构分析  54-55
      3.2.5.2 CUEDC2(1-133)的初始结构计算  55-56
      3.2.5.3 CUEDC2(1-133)的溶液结构计算过程如下  56-57
      3.2.5.4 CUEDC2(1-133)的初始结构  57-59
第五章总结与展望  59-61
参考文献  61-64
综述：核磁共振技术在结构解析与生物学功能上的应用  64-72
  参考文献  70-72
附录  72-84
  附录一  72-73
  附录二  73-74
  附录三  74-83
  附录四  83-84
致谢  84

CUEDC2的溶液结构及其与泛素相互作用的核磁共振研究

内容摘要

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