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CD147分子在肺腺癌A549细胞生物学行为中的功能和作用的研究

作　者: 杨绍兴
导　师: 宋三泰; 刘晓晴
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药理学
关键词: CD147 A549 慢病毒载体 RNA干涉转染
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

恶性肿瘤因其快速生长和进展的生物学特性，以及缺乏有效的早期诊断手段，病死率高、预后差，己成为严重威胁人类健康的重要疾病。肺癌是发病率和病死率均居第一位的肿瘤，其中非小细胞肺癌占80%，按其病理分型依次递减为腺癌、鳞癌、大细胞肺癌等。腺癌易发生血行转移，近年的研究又发现其所占比例有所增长，成为女性和年轻患者中最为常见的一种类型，因此对肺腺癌细胞的生物学特性进行深入的研究有着非常重要的意义。CD147，又称基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinaseinducer, EMMPRIN），来源于人肺癌细胞系LX-1，属于免疫球蛋白超家族，能够刺激成纤维细胞产生大量基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)。MMPs可介导基底膜组成成分和细胞外基质大分子的重塑，促进肿瘤的浸润和转移，诱导肿瘤血管的生成。在胸腺上皮、视网膜色素上皮细胞等正常细胞中主要由角化细胞表达低水平的CD147，但是在恶性肿瘤中，CD147表达常较高，目前已在肺癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞等中克隆出CDl47。众多研究表明，CD147是一个在多种生理或病理过程中发挥重要作用的关键分子，尽管其功能和作用在其它类型肿瘤中已见研究报道，但在肺腺癌细胞中还未见明确的实验证实。为了使研究结果更具对比性，有更可靠的说服力，我们拟构建稳定表达CD147和干涉CD147两种A549细胞系，对照性分析CD147在肺腺癌细胞系A549中的功能和作用。肿瘤细胞从原位增殖到浸润、转移是一个多因素参与、多步骤的复杂过程，包括基底膜降解、基质渗透、肿瘤细胞进出血管和对靶组织的侵袭等。尽管肿瘤有多种不同类型，但却有一个显著相似的、共同促进肿瘤生长和发展的生物学特性。肿瘤细胞高表达的CD147使得MMPs表达数量及活性增加，从而降解基底膜的主要成分，破坏天然组织的机械屏障，促进肿瘤的浸润和转移。同时MMPs对细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的降解可使以储存形式而无生物学活性的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）从ECM中释放出来并具有生物活性，VEGF是内皮细胞的特异性激活因子，可使小血管的通透性增加，导致血浆蛋白外漏和血管外纤维蛋白胶体形成，不仅为内皮细胞生长提供合适的环境，而且导致肿瘤内部的组织间压增高，阻碍营养物、氧和治疗药物向肿瘤的输送，并刺激新血管的生长。对其进行的调控可直接影响到肿瘤血管的形成。增殖是细胞延续生命的形式，肿瘤细胞也不例外，抑制细胞增殖，是治疗肿瘤的重要方面。我们对所构建的细胞系进行了细胞增殖实验对比，发现过表达CD147组的细胞增殖速度明显快于其它几组，而干涉CD147组的细胞增殖速度最慢，表明CD147表达量的高低与肺腺癌细胞的增殖速度成正比。对其活性的抑制，可以使肺腺癌细胞的增殖速度降低，CD147是一个在肺腺癌细胞增殖中发挥重要作用的分子。浸润与转移是恶性肿瘤危及生命的最主要生物学特性，也是临床治疗恶性肿瘤的主要障碍和造成肿瘤患者死亡的主要原因。因此，能够抑制肿瘤浸润、转移的过程，是治疗肿瘤最直接、最有效的方法。我们通过对比穿透Matrigel胶细胞数发现，高表达CD147的细胞有着更强的浸润能力，而下调CD147的表达可使肿瘤细胞的浸润能力降低，浸润的过程减慢。说明CD147可影响A549细胞的浸润能力，上调其表达，可以使A549细胞的浸润能力增强，而下调其表达，可以使A549细胞的浸润能力降低。随后的划痕试验显示CD147在促进肺腺癌细胞转移方面有着同样的作用。证实CD147分子在促进肺腺癌细胞浸润和转移过程中发挥着重要的作用。这些结果提示我们，可通过对CD147表达的抑制，来降低肺腺癌细胞的侵袭和转移能力。肿瘤新生血管的形成对原发肿瘤细胞本身的增殖和生长是必不可少的，同时也是肿瘤侵袭转移的必要条件，贯穿肿瘤转移的全过程。在参与血管形成的众多因子中，VEGF被认为是最强大、最重要的因子。我们通过实时PCR和Westernblot的方法，在mRNA和蛋白两个水平对所建细胞系的VEGF表达量进行检测，结果显示VEGF的表达水平可随着CD147分子的表达增高而增高，降低而降低。说明CD147分子可以正向调控VEGF的表达。随后的检测内皮细胞的管腔形成能力的实验结果与CD147调节VEGF变化情况是一致的。与对照组相比，过表达CD147组的管腔形成最多，而干涉CD147组形成的管腔最少。这充分说明CD147可高效调节VEGF的表达，从而影响到血管的生成。我们的结果与在其它肿瘤细胞实验中得到结论一致。VEGF是抗肿瘤血管治疗最有效的靶点，其靶向药物贝伐单抗已被NCCN指南中规定为非小细胞肺癌的一线用药。虽然已被应用于临床，但由于缺乏有效的预测指标，临床获益率不高。寻找其可靠的获益指标有着非常重要的意义。根据CD147在各个类型肿瘤中均呈高表达且可调节VEGF表达的特点，已有学者进行了CD147作为其预测指标的研究。其在头颈部肿瘤的动物实验中发现，高表达CD147组应用贝伐单抗的效果最好。从我们的初步研究结果推测，CD147可在促进肺腺癌A549细胞的增殖、浸润、转移，上调VEGF的表达，进而刺激肿瘤的血管生成方面发挥着重要的作用，可能是肿瘤治疗的一个潜在靶点。我们下一步的工作将对CD147的功能及其调节机制进行更深入的研究。

全文目录

缩略词表  4-6
摘要  6-9
Abstract  9-12
前言  12-16
第一部分 CD147 慢病毒载体的构建及稳定转染 A549 细胞系的建立  16-48
  实验材料  16-17
  实验方法  17-32
  实验结果  32-44
  讨论  44-48
第二部分 CD147 对肺腺癌 A549 细胞生物学功能特性的影响  48-68
  实验材料  48-49
  实验方法  49-58
  实验结果  58-66
  讨论  66-68
结论  68-70
参考文献  70-76
附录  76-80
  主要仪器  76-78
  主要试剂  78-80
与学位论文密切相关的该研究领域文献综述（全文）  80-88
  参考文献  84-88
在学期间发表的与学位论文密切相关的代表性论著（全文）  88-102
个人简历  102-104
致谢  104

CD147分子在肺腺癌A549细胞生物学行为中的功能和作用的研究

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