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外源性HSP70基因在人肺癌A549细胞中的表达及其对A549细胞生长的影响

作　者: 李媛媛
导　师: 葛正龙
学　校: 遵义医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: HSP70 转染 A549细胞 MTT FCM 细胞增殖细胞周期
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：将以外源性HSP70为目的基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-HSP70转染入人肺癌A549细胞,观察其在A549细胞中的表达及对A549细胞生长的影响,以期为进一步研究HSP70作用于肺癌的分子机制提供实验依据。方法：(1)采用碱裂解法从重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-HSP70和空载体粒pIRES2-EGFP中抽提质粒DNA；(2)使用含10%胎牛血清的LG-DMEM培养基,于37℃、5%C02饱和湿度环境下培养A549细胞；(3)应用阳离子脂质体转染法将上述质粒分别转染入A549细胞；(4)实验分组：未转染细胞对照组(NC)、转染试剂对照组(TC)、空载体对照组(EC)、实验组(HSP70)。(5)荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白(GFP)报告基因表达情况,并应用流式细胞术(FCM)检测转染后36h的转染效率；(6)对HSP70 mRNA的表达水平进行实时荧光定量PCR (real-time PCR)检测；(7)MTT法检测外源HSP70基因对转染细胞增殖的影响；(8)FCM检测外源HSP70基因对A549细胞周期变化的影响。结果：(1)转染后12h、24h、36h、48h均可在荧光显微镜下观察到GFP表达阳性细胞,其中转染后36h阳性细胞数目最多表达最强,转染效率为38.57%；(2)实验组各时间段HSP70 mRNA表达水平均较对照组明显增高,提示外源性HSP70基因能在A549细胞中高效表达；(3)实验组能显著抑制A549细胞的增殖(P<0.01),且转染后48h抑制率最高；(4)与对照组相比,转染后36h实验组细胞Go/G1期比例明显增多,而S期比例降低。结论：成功将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-HSP70转染入人肺癌A549细胞后,外源性HSP70基因能够在A549细胞中有效表达；高表达的HSP70可显著抑制A549细胞的增殖,并引起细胞周期阻滞于Go/G1期。

外源性HSP70基因在人肺癌A549细胞中的表达及其对A549细胞生长的影响

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