学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

HPD、NLK调控NF-kB通路和TGFβ通路及机制研究

作　者: 张力民
导　师: 杨晓明
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: HPD NF-κB 肺癌 NLK TGFβ
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 315次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


本论文包括两部分内容,一是羟苯丙酮酸二加氧酶(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, HPD)正调控NF-κB通路促进肺癌细胞存活和迁移。二是NLK通过Smad4(?)印制TGFβ信号通路活性。中国有句成语：物以类聚,人以群分。在生物学研究中也适用这样的准则。功能相关的蛋白质通常以相互联系的方式调节复杂的生物学过程。因此,蛋白质相互作用是发现未知蛋白功能或已知蛋白质新功能的重要手段。我们实验室前期利用酵母双杂交技术平台构建了大规模的蛋白质相互作用网络,发现了大量新的蛋白质间相互作用[1]。这个蛋白质相互作用网络为我们提供了很多线索和提示。本课题选取该网络中发现的可能具有重要生物学意义的两对蛋白质间相互作用—HPD与NEMO和NLK与Smad4进行了深入研究。HPD是酪氨酸分解代谢途径的关键酶[2]。NEMO是NF-κB信号通路的核心分子[3]。采用外源和内源免疫共沉淀实验我们验证了HPD与NEMO的相互作用,确定HPD通过N端与NEMO的N端发生相互作用,并证明HPD可能与IKK组成蛋白质复合体。过表达HPD加速IKBα的降解,促进NF-κB报告基因活性,增加TNFa诱导的NF-κB靶基因BCL-xL、cIAP2、ICAM-1、VCAM-1的表达；利用RNAi敲低HPD表达则抑制NF-κB报告基因的活性；HPD酶活性突变不影响HPD调节NF-κB通路的作用,HPD的催化底物-羟苯丙酮酸(HPP)和催化产物-尿黑酸(HGA)对NF-κB通路也无影响。这些结果说明HPD以不依赖酶活性的方式正调控NF-κB通路。机制上,我们发现过表达HPD可以增强TNFα刺激引起的NEMO泛素化修饰。利用RT-PCR技术检测HPD在小鼠各器官组织的表达,结果显示HPD仅在肝脏和肾脏表达,这与文献报道一致[4]。有意义的是,检测多种细胞系中HPD的表达,发现除肝实质细胞来源细胞系外,多株肺癌细胞中也表达HPD。为进一步验证HPD在肺癌组织中的表达及与NF-κB活性的关系,我们利用免疫组织化学技术检测了HPD及磷酸化p65(S276)在肺癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况,发现HPD在肺癌组织中的表达强度和阳性细胞率都显著高于癌旁肺组织,并与磷酸化p65(S276)的表达呈正相关。进一步,利用慢病毒介导的RNAi敲低肺癌细胞A549和H1299的HPD表达,结果发现HPD下调对肺癌细胞的细胞周期和增殖没有明显影响,但克隆形成实验和Transwell实验结果显示,敲低HPD显著抑制了肺癌细胞的克隆形成能力和迁移能力。综上,我们的实验结果发现HPD在肺癌组织中异常表达,下调其表达可减低肺癌细胞的恶性表型,机制上可能与HPD通过与NEMO的相互作用,以不依赖酶活性的方式激活NF--κB通路有关,提示HPD可能在肺癌的发生发展中起重要作用。NLK是一种保守的丝／苏氨酸蛋白激酶,识别的保守序列为S/TP基序,通过磷酸化底物的方式参与多种生物学过程[5-9]。采用免疫共沉淀和GST pull down我们证明NLK能与Smad4发生相互作用。进一步,我们初步实验的结果发现NLK以不依赖激酶的方式负调控TGFβ信号通路,机制上可能与促进Smad4的泛素化修饰,降低Smad4(?)勺稳定性有关,但其生物学意义尚有待深入研究。

全文目录


目录  3-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
缩略词表  10-11
前言  11-17
  一、NF-κB信号通路  11-14
  二、TGFβ信号通路调控  14-17
第一部分 HPD正调控NF-κB通路促进肺癌细胞存活和迁移  17-50
  一、材料与方法  17-21
    1. 质粒、试剂、抗体、实验动物  17
    2. RNA干涉实验  17-18
    3. RNA提取、反转录和实时定量PCR  18
    4. 荧光素酶报告基因实验  18-19
    5. 免疫共沉淀  19
    6. 泛素化实验  19
    7. 慢病毒干涉载体构建、包装、感染细胞  19-20
    8. TNFα、VP16、PMA、HGA、HPP处理细胞  20
    9. 免疫组化  20
    10. 细胞周期实验  20-21
    11. 细胞增殖实验  21
    12. 细胞迁移和克隆形成实验  21
  二、结果  21-46
    1. HPD与NEMO体内相互作用实验  21-23
    2. HPD,NEMO和IKKβ可形成复合体  23-25
    3. HPD与NEMO的结合区域  25-26
    4. 过表达HPD激活NF-κB报告基因活性  26-28
    5. 过表达HPD促进NF-κB靶基因表达  28-29
    6. 过表达HPD促进IκBα的降解  29-30
    7. 敲低HPD抑制NF-κB报告基因活性  30-32
    8. HPD激活NF-κB通路不依赖其代谢酶活性  32-34
    9. HPD促进NEMO的泛素化  34-36
    10. HPD在肺癌细胞株和肺癌组织中高表达  36-38
    11. 肺癌中HPD表达与NF-κB通路活性正相关  38-41
    12. 慢病毒干涉载体的构建与病毒包装  41-43
    13. HPD提高肺癌细胞克隆形成和迁移能力  43-46
  三、讨论  46-50
第二部分 NLK通过Smad4负调控TGFβ信号通路  50-58
  一、材料与方法  50-52
    1. 质粒,抗体,试剂  50-51
    2. TGFβ,放线菌酮和MG132处理细胞  51
    3. 免疫共沉淀  51
    4. GST-pull down  51
    5. 荧光素酶报告基因实验  51
    6. Smad4稳定性实验  51-52
    7. 泛素化实验  52
  二、结果  52-57
    1. NLK与Smad4相互作用  52-53
    2. NLK通过Smad4抑制TGFβ信号通路  53-55
    3. NLK促进Smad4的降解和泛素化修饰  55-57
  三、讨论  57-58
参考文献  58-70
附录  70-90
  附录1.常用实验技术详细步骤  70-74
  附录2.常用实验试剂的配制  74-77
  附录3.主要仪器设备  77-78
  附录4.实际所用PCR引物序列  78-80
  附录5.综述  80-90
    参考文献  85-90
个人简介  90-91
致谢  91

相似论文

  1. 125I粒子植入对晚期肺癌治疗效果的临床研究,R734.2
  2. 核蛋白NDP52与肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6相互作用及临床意义的研究,R363
  3. GATA2与Smad4相互作用对TGFβ信号通路负调控的初步研究,R363
  4. 卷曲螺旋蛋白52与TRAF6及其家族成员相互作用对NF-κB通路的影响研究,R363
  5. 硒对饮水型氟中毒致脑损伤的干预分子机理研究,R599
  6. 经鼻给予转化生长因子-β1对氯化锂—匹罗卡品诱导的癫痫持续状态大鼠海马神经元的保护作用,R742.1
  7. 5-Aza-dC对肺癌SPC-A-1细胞p16、MGMT基因甲基化及其表达的影响,R734.2
  8. 联合检测血清TPS，CEA，CYFRA21-1，NSE在肺癌诊断中的临床价值,R734.2
  9. Toll样受体4信号通路在脂多糖促进肺癌细胞增殖中的机制探讨,R734.2
  10. NF-κB与IL-6在大鼠极限门静脉结扎模型中的表达及作用机制,R657.3
  11. 乳杆菌代谢产物RNA组分序列分析及对其部分生物学功能的研究,R378
  12. 金钗石斛多糖减轻脂多糖诱导的大鼠学习记忆减退及机制研究,R285.5
  13. RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响（体外实验）,R734.2
  14. 糖康对糖尿病大鼠和血管内皮细胞的作用及其机制研究,R285.5
  15. 解氏肺癌二号方对小鼠Lewis肺癌伴胸水治疗价值的研究,R734.2
  16. 硅化合物SILA409对人小细胞肺癌GRP78表达及与VP-16耐药的研究,R734.2
  17. 顺铂对小鼠肺癌细胞中P-糖蛋白表达的影响,R734.2
  18. 无血清培养联合顺铂富集人肺癌干细胞的体外基础研究,R734.2
  19. 解氏肺癌2号方对肺癌伴恶性胸水治疗的临床对照研究,R734.2
  20. 蛇床子素对博莱霉素致肺纤维化动物的干预作用及其机制研究,R563.9
  21. MMP-2、VEGF、CD105、Ki67在小细胞肺癌组织中的表达及预后相关性研究,R734.2

中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
© 2012 www.xueweilunwen.com