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人α-半乳糖苷酶A突变体的构建、表达及生化性质的初步研究

作　者: 让文亮
导　师: 季守平
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 法布莱氏病 α-半乳糖苷酶A 基因突变 生化性质
分类号: R725.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 24次
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内容摘要


法布莱氏病（Fabry disease）,是一种罕见的X染色体连锁遗传的鞘糖脂类代谢疾病,由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A,GLA或α-Gal A）基因突变造成[1]。α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A,GLA）的缺失可导致其底物球形三脂酰基鞘鞍醇（Gb3）和糖苷神经鞘脂类在全身细胞、组织和器官中累积,引起血液循环障碍并进一步导致心、肾功能衰竭和神经系统紊乱而死亡[2]。法布莱氏病的发病率为1/40001/11700[3],大多在儿童和青少年时期发作,若不及时治疗,一般在40岁左右就会死亡。酶替代疗法是目前治疗法布莱氏病最有效的方法[4]。而获得足量、高活性的GLA是进行酶替代疗法的关键。由于GLA是一种糖蛋白,糖基化对其功能的影响至关重要,而哺乳动物细胞表达系统的糖基化修饰功能与人类相同,是表达GLA系统的首选体系,但存在表达量低的缺陷。这成为本实验的一个制约因素。据文献报道[5],mRNA5’非翻译区和编码区的核苷酸序列的改变,能有效的提高其翻译效率。据此,我们拟通过改变GLA mRNA编码区的核苷酸序列来提高蛋白的表达效率。首先,构建含野生型和突变型GLA基因的真核表达载体并转染哺乳动物细胞,筛选获得高表达GLA的单克隆细胞。其次,优化GLA蛋白诱导表达的条件,大规模培养高表达GLA的宿主细胞。再次,建立GLA分离、纯化的方法,获得高纯度的GLA。最后,对重组GLA的理化性质及生化特性进行初步分析。主要研究内容及研究结果有:1.重组质粒的构建通过RT-PCR方法从SMMC-7721细胞中克隆cDNA。设计引物,扩增野生型GLA基因及突变型GLA基因（起始密码子后的第一个碱基由胞嘧啶突变为鸟嘌呤）。将扩增的基因连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A质粒（在C末端含有6×His标签,这方便后续的纯化;含有新霉素（neomycin）基因,易于对阳性克隆的筛选）上。经酶切鉴定及测序分别证实我们获得了含野生型和突变型GLA基因的重组质粒,并将其命名为pcDNA3.1/myc-His A-GLA和pcDNA3.1/myc-His A-mutation-GLA。2.阳性克隆的筛选及诱导条件的优化将构建的重组质粒分别转染CHO细胞和HEK293细胞,经用G418筛选获得4种抗性克隆。检测各种克隆表达的GLA活性,从每种克隆中各选择一株GLA活性最高单克隆细胞,将转染野生型和突变型GLA基因的CHO细胞分别命名为CHO（GLA）和CHO（m-GLA）,转染野生型和突变型GLA基因的HEK293细胞分别命名为HEK293（GLA）和HEK293（m-GLA）。将这4株单克隆细胞以相同的条件培养,并加丁酸钠诱导72h,检测培养上清分泌的蛋白活性,发现CHO（GLA）、CHO（m-GLA）、HEK293（GLA）和HEK293（m-GLA）培养上清的GLA蛋白活性分别为:8.3×106、14.2×106、0.5×106和1.4×106U/L。可见,对于同种宿主细胞,转染含突变型GLA基因质粒的细胞比转染含野生型GLA基因质粒的细胞培养上清的GLA活性明显要高;而且转染同种质粒后,对CHO细胞来说,表达蛋白的活性也明显高于HEK293细胞。随后我们对CHO（GLA）和CHO（m-GLA）细胞密度、诱导剂量及诱导时间等条件进行优化,得出在6孔板中每孔培养50万个细胞效果最好,细胞密度过高,空间不足;密度过低,蛋白表达量不高。对于丁酸钠剂量,诱导剂量较低时,表达量则很低,剂量升高时蛋白表达量也随之升高,当浓度高于10mmol/L时,蛋白表达量没有明显升高。随着诱导时间的延长,蛋白表达量会升高,在60h左右达到最高值,若时间过长,一方面,细胞会死亡;另一方面,表达的蛋白易于失活。所以我们选择60h作为最佳诱导时间。3.表达产物的鉴定扩大培养CHO（GLA）和CHO（m-GLA）细胞,10mmol/L丁酸钠诱导60h后,收集培养上清,并用HisTrapTM FF柱纯化。纯化后的样品经SDS-PAGE分析,发现在50kd附近有清晰的条带,与GLA相符,提示纯化产物可能是重组的GLA蛋白。经灰度扫描,纯度分别为95.2%（野生型GLA）和95.8%（突变型GLA）,说明产物纯度较高。由于构建的载体在C末端含有6×His标签,我们接着对纯化的样品分别用抗GLA和抗6×His的抗体进行蛋白免疫印迹分析,发现两种抗体均可在50kd附近检测到明显的信号,进一步表明纯化产物为重组GLA蛋白。对纯化前后蛋白比活性的比较发现,在纯化前突变型和野生型GLA比活性分别为0.0029×106和0.0316×106U/mg;纯化之后的野生型GLA的比活性（0.69×106U/mg）与商品化的GLA（0.77×106U/mg）相当,而突变型GLA的比活性（1.78×106U/mg）则是商品化的GLA的2.3倍,提示突变型GLA的蛋白活性是野生型的2-3倍。由于纯化前突变型GLA的比活性大约是野生型GLA的10倍,提示基因突变除了能够显著增加GLA蛋白活性外,还能提高mRNA的翻译效率。4.GLA生化性质的研究对纯化后的样品,我们测定其相对分子量、最适反应pH、最适反应温度及酶反应动力学参数Km和Vmax等生化性质。通过质谱分析,野生型和突变型GLA分子量分别是54.9×103和54.8×103,略大于推算的分子量,这可能是由GLA糖基化引起的。其最适反应pH在4.6附近,与标准品相似。两者最适反应温度随着温度的升高逐渐增强,在37℃时达到最大,这点也与标准品相似,但标准品在较低温度时酶的活性比我们表达的两种GLA活性略高。通过对米氏常数和最大反应速度的研究,我们发现野生型GLA的Km为2.39μmol/L, Vmax为0.0034μmol/min;突变型GLA的Km为1.27μmol/L, Vmax为0.0036μmol/min;标准品Km为3.45μmol/L, Vmax为0.0045μmol/min。提示突变型GLA对底物的亲和力最高,标准品对底物的亲和力最低,但标准品比其他两者的Vmax要略高,这也解释了突变型GLA比野生型GLA的比活高的原因。以上结果表明,我们通过定点突变的方法构建了含突变型GLA基因的重组质粒,并且转染CHO细胞和HEK293细胞,获得表达高活性GLA的单克隆细胞,其中转染突变型GLA基因的CHO细胞[CHO（m-GLA）]的GLA表达水平最高。我们优化了单克隆细胞诱导表达条件并进行大规模培养,发现CHO（m-GLA）细胞培养上清的GLA比活性是CHO（GLA）细胞的10倍。收集并纯化培养上清,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹鉴定,证实通过一步亲和层析即可获得较高纯度的GLA蛋白。对纯化产品的活性及理化性质分析结果显示,突变型GLA蛋白的主要生化性质没有发生改变,但对底物的亲和力及活性明显提高,推断突变不仅可以增加GLA mRNA的翻译水平,而且可引起蛋白空间结构的改变,从而提高GLA的活性。总之,我们获得了高表达突变型GLA的CHO细胞株,并且重组GLA高纯度、高活性,为下一步生产重组GLA并最终用于法布莱氏病的治疗奠定了坚实的基础。

全文目录


英文缩略词表  6-8
摘要  8-11
Abstract  11-15
前言  15-18
第一部分 重组质粒的构建  18-27
  1.1 实验材料  18-19
    1.1.1 菌种、细胞和质粒  18
    1.1.2 主要试剂  18
    1.1.3 溶液的配制  18-19
    1.1.4 主要仪器  19
  1.2 实验方法  19-22
    1.2.1 人GLA cDNA的克隆  19-20
    1.2.2 人GLA重组质粒的构建  20-22
  1.3 实验结果  22-26
    1.3.1 人GLA cDNA的克隆  22
    1.3.2 人GLA重组质粒的构建  22-26
  1.4 讨论  26-27
第二部分 阳性克隆的筛选及诱导条件的优化  27-37
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 细胞系  27
    2.1.2 主要试剂  27
    2.1.3 溶液的配制  27
    2.1.4 主要仪器  27-28
  2.2 实验方法  28-29
    2.2.1 重组质粒的转染  28
    2.2.2 重组质粒阳性克隆的筛选  28
    2.2.3 重组人GLA的诱导表达  28
    2.2.4 测定阳性克隆上清中重组人GLA的活性  28-29
    2.2.5 重组人GLA的诱导条件的优化  29
  2.3 实验结果  29-35
    2.3.1 单克隆细胞的筛选  29-32
    2.3.2 4-MUF标准曲线的绘制  32
    2.3.3 单克隆细胞GLA活性检测  32-33
    2.3.4 重组人GLA诱导条件的优化  33-35
  2.4 讨论  35-37
第三部分 表达产物的纯化及鉴定  37-45
  3.1 实验材料  37-39
    3.1.1 细胞系  37
    3.1.2 主要试剂  37
    3.1.3 溶液的配制  37-39
    3.1.4 主要仪器  39
  3.2 实验方法  39-41
    3.2.1 细胞培养  39
    3.2.2 培养上清的纯化及浓缩  39-40
    3.2.3 重组表达产物的鉴定  40-41
    3.2.4 纯化前后蛋白活性比较  41
  3.3 实验结果  41-44
    3.3.1 表达产物的纯化  41-42
    3.3.2 重组表达产物的SDS-PAGE分析  42-43
    3.3.3 重组表达产物的免疫印迹检测  43
    3.3.4 CHO(GLA)和CHO(m-GLA)单克隆纯化前后活性比较  43-44
  3.4 讨论  44-45
第四部分 GLA生化性质的研究  45-51
  4.1 实验材料  45
    4.1.1 主要试剂  45
    4.1.2 主要仪器  45
  4.2 实验方法  45-46
    4.2.1 相对分子量测定  45
    4.2.2 最适反应pH  45-46
    4.2.3 最适反应温度  46
    4.2.4 酶反应动力学参数的测定  46
  4.3 实验结果  46-49
    4.3.1 相对分子量测定  46-47
    4.3.2 最适pH反应  47-48
    4.3.3 最适温度反应  48-49
    4.3.4 酶反应动力学参数的测定  49
  4.4 讨论  49-51
全文总结  51-53
参考文献  53-56
综述  56-69
  参考文献  66-69
个人简历  69-70
致谢  70

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中图分类: > 医药、卫生 > 儿科学 > 小儿内科学 > 小儿全身性疾病
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