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来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的研究

作　者: 王慧
导　师: 姚斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 α-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷酶模拟人工胃液
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)和β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是自然界中广泛存在的两类糖苷水解酶,能从一系列化合物中释放以α-或β-键连接的D-半乳糖。利用α-半乳糖苷酶可以对半乳甘露聚糖进行酶法改性,使改性后的产品具有更多优良的性能,从而使其能够广泛的应用于食品,医药和造纸等行业。β-半乳糖苷酶则可以将乳制品中的乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,利用微生物产的β-半乳糖苷酶生产口服剂,可以有效地缓解因不能吸收乳糖而引起的“乳糖不耐症”。本研究从嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1中克隆到三个α-半乳糖苷酶基因和一个β-半乳糖苷酶基因,使其在毕赤酵母中进行表达并进行相关酶学性质的研究。三个α-半乳糖苷酶AgalA、AgalB和AgalC都属于27家族糖苷水解酶。AgalA和AgalC与Lachancea thermotolerans (耐热克鲁维酵母)来源的α-半乳糖苷酶相似性最高均为52%,而AgalA与AgalC两者间的氨基酸一致性仅为57.6%; AgalB则与Penicillium simplicissimum (青霉)来源的α-半乳糖苷酶有最高一致性为36%, AgalB与AgalA和AgalC的氨基酸一致性分别为24.9%和27.2%。三个重组α-半乳糖苷酶的最适pH分别为5.5、3.5和7.0,最适温度分别为55°C、55°C和45°C。AgalA、AgalB和AgalC对不同底物表现出不同的特异性: AgalA只对合成底物pNPG有降解能力,对蜜二糖、棉子糖和水苏糖等半乳寡糖均不表现其活性;而AgalB则不仅能催化pNPG、蜜二糖、水苏糖和棉子糖等小分子半乳寡糖,而且对瓜尔豆胶和角豆胶等半乳甘露聚糖也有较高的水解能力; AgalC对不同底物的特异性与AgalB类似。AgalA、AgalB和AgalC的比活分别为31.2 U/mg、581 U/mg和128.8 U/mg。AgalB与同来源的β-甘露聚糖酶Man5A协同降解瓜尔豆胶的实验结果表明: AgalB不仅能单独对瓜尔豆胶侧链的半乳糖残基进行降解,而且能与Man5A一起协同降解瓜尔豆胶。延长AgalB对侧链的作用时间,能显著地促进Man5A对主链的降解。而且随着作用温度的提高,反应速率加快,产物中的还原糖含量也随之增加。AgalA与AgalC则均不能与Man5A发生协同作用。β-半乳糖苷酶BgalA属于糖苷水解酶35家族,其最适pH为1.5,最适温度为60°C。BgalA在整个pH范围内均能保持稳定。有很好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力。大多数金属离子对其酶活性没有显著地影响。重组酶的比活为99.5 U/mg。BgalA对ONPG和乳糖两种底物的Km值分别5.22 mM和0.31 mM, Vmax值分别为120.8μmol/(min·mg)和137.3μmol/(min·mg)。与商业化的Aspergillus oryzae来源的β-半乳糖苷酶相比, BgalA在整个模拟人工胃液条件下均能稳定的存在,且重组BgalA对牛奶中的乳糖的水解率可达85.8%,而作为对照的A. oryzae来源的β-半乳糖苷酶在动态模拟人工胃液条件下对乳糖的水解率只能达到3.5%。综合以上实验结果:α-半乳糖苷酶AgalB和β-半乳糖苷酶BgalA不仅耐酸,而且对胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很好的抗性,具有很好的工业应用前景。本研究为其将来的工业应用打下了良好的基础。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章引言  11-23
  1.1 α-半乳糖苷酶的研究进展  11-17
    1.1.1 α-半乳糖苷酶的来源  11-12
    1.1.2 α-半乳糖苷酶的诱导  12-13
    1.1.3 α-半乳糖苷酶的性质  13-14
    1.1.4 α-半乳糖苷酶的分子特性  14-15
    1.1.5 α-半乳糖苷酶的底物特异性  15-17
    1.1.6 α-半乳糖苷酶的应用  17
  1.2 β-半乳糖苷酶的研究进展  17-21
    1.2.1 β-半乳糖苷酶概述  17-18
    1.2.2 β-半乳糖苷酶的性质  18-19
    1.2.3 β-半乳糖苷酶的基因克隆与表达  19-20
    1.2.4 β-半乳糖苷酶的结构  20-21
    1.2.5 β-半乳糖苷酶的应用  21
  1.3 毕赤酵母表达系统  21-22
  本研究的目的和意义  22-23
第二章来源于嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 的三个α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及性质研究  23-52
  2.1 实验材料  23-24
    2.1.1 菌株和质粒  23
    2.1.2 引物合成  23
    2.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  23
    2.1.4 主要仪器  23
    2.1.5 培养基及主要溶液的配制  23-24
  2.2 实验方法  24-36
    2.2.1 α-半乳糖苷酶基因AgalB 和AgalC 的克隆  24-29
    2.2.2 三个α-半乳糖苷酶基因AgalA, AgalB, AgalC 在毕赤酵母中的表达  29-33
    2.2.3 三个重组α-半乳糖苷酶的纯化及脱糖基化处理  33-35
    2.2.4 三个重组α-半乳糖苷酶的酶学性质测定  35
    2.2.5 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 来源的 AgalB 和 Man5A 协同作用实验  35-36
  2.3 结果与分析  36-50
    2.3.1 α-半乳糖苷酶基因AgalB 和AgalC 的克隆  36-40
    2.3.2 α-半乳糖苷酶基因AgalA, AgalB, AgalC 在毕赤酵母中的表达  40-41
    2.3.3 α-半乳糖苷酶AgalA, AgalB, AgalC 的纯化  41-43
    2.3.4 α-半乳糖苷酶AgalA, AgalB, AgalC 的酶学性质分析  43-48
    2.3.5 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 来源的 AgalB 和 Man5A 共作用降解实验  48-50
  2.4 讨论  50-52
第三章来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 的β-半乳糖苷酶基因的表达及性质研究  52-64
  3.1 实验材料  52-53
    3.1.1 菌株和质粒  52
    3.1.2 引物合成  52
    3.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  52
    3.1.4 主要仪器  52
    3.1.5 培养基及有关溶液的配制  52-53
  3.2 实验方法  53-57
    3.2.1 真核表达载体pPIC9-BgalA 的构建  53-54
    3.2.2 β-半乳糖苷酶基因BgalA 在毕赤酵母中的表达  54-55
    3.2.3 β-半乳糖苷酶BgalA 的纯化  55
    3.2.4 β-半乳糖苷酶BgalA 的酶学性质测定  55-56
    3.2.5 嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 来源的BgalA 在模拟人工胃液条件下水解牛奶实验  56-57
  3.3 结果与分析  57-62
    3.3.1 真核表达载体pPIC9-BgalA 的构建  57
    3.3.2 β-半乳糖苷酶基因BgalA 在毕赤酵母中的表达  57-58
    3.3.3 β-半乳糖苷酶BgalA 的纯化  58
    3.3.4 β-半乳糖苷酶BgalA 的酶学性质测定  58-60
    3.3.5 嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 来源的BgalA 与商业乳糖酶在模拟人工胃液条件下水解牛奶实验  60-62
  3.4 讨论  62-64
第四章全文结论  64-65
参考文献  65-75
致谢  75-76
作者简历  76

来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1的α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶的研究

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