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诊治法布莱氏病的单抗及重组蛋白的研制

作　者: 徐莉娟
导　师: 章扬培
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 法布莱氏病 α-半乳糖苷酶诊断合成多肽单克隆抗体治疗重组蛋白表达
分类号: R596.1
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

法布莱氏病是一种X连锁隐性遗传病，由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A（alpha-galactosidaseA，α-GalA）基因突变使酶失活造成。研究表明，人体内α—半乳糖苷酶的先天性缺乏而致使其底物N-脂酰鞘氨醇己三糖苷在全身细胞、组织和器官中累积而引起血液循环障碍并进一步导致心、肾功能衰竭和神经系统紊乱而死亡。法布莱氏病在男性中发病率为1／40000，而且在早期一般很难诊断。若不能及时诊断治疗，患者一般在40岁左右就会死于心、肾功能衰竭和神经系统紊乱，女性发病时间稍晚，一般在40-50岁发病。法布莱氏病的早期诊断治疗对阻止病情发展，改善病人生存质量，延长病人生存时间具有重要意义。利用α-半乳糖苷酶A单抗检测患者体内的α-半乳糖苷酶A蛋白水平是法布莱氏病早期诊断的可靠方法。为了获得效价高的、特异性强的抗人α-半乳糖苷酶A单克隆抗体，本文使用计算机软件分析α-半乳糖苷酶A的优势抗原表位，合成2个具有强抗原性的多肽并与载体蛋白KLH偶联，免疫小鼠，采用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞株。使用酶联免疫、SDS-PAGE、Western-Blot和染色体核型分析等方法对杂交瘤细胞及其产生的单抗进行鉴定。筛选到1株稳定表达α-半乳糖苷酶A单抗杂交瘤细胞株。制备的单抗属IgG1亚型，能够特异性地与人α-半乳糖苷酶A反应，并展示出很强的亲和力。采用酶联免疫方法用获得的单克隆抗体检测12例正常人及5例法布莱氏病患者血浆中的α-半乳糖苷酶A。结果患者组的OD₄₅₀吸光度平均值为0.159±0.063（最大0.238，最小0.080），低于正常组的平均吸光度值0.481±0.116（最大0.694，最小0.332）。同时酶活性检测血浆中α-半乳糖苷酶活性，患者组的吸光度平均值为0.015±0.008（最大0.024，最小0.004），低于正常组的吸光度平均值0.032±0.006（最大0.044，最小0.022）。但是在抗体检测的结果中一例患者的OD₄₅₀吸光度值接近正常人的，这是因为有的病人α-半乳糖苷酶A蛋白有较高的表达水平，却无水解活性。将单抗检测与酶活性检测相结合，可以增加了断的可靠性，为进一步研究法布莱氏病的诊断奠定了基础。向病人体内注射α-半乳糖苷酶A的酶替代疗法是目前治疗法布莱氏病最有效的方法，但如何获得足量、高纯度的α-半乳糖苷酶A是使用酶替代疗法的前提。本文的另一个目的是克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶A cDNA，测序结果说明获得的序列与文献报道一致。将α-半乳糖苷酶A cDNA构建到可用甲醇诱导的分泌型毕赤酵母表达载体pPICZαA。重组载体导入毕赤酵母后使用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后，使用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法检测酵母上清中人α-GalA。我SDS-PAGE结果表明在酵母培养上清中有大约46KD的条带，与预期的α-GalA的大小一致，该条带能够特异的与抗α-GalA单抗结合。进一步研究表明培养上清中有α-GalA活性。研究结果初步证明，我们获得了具有生物活性重组的α-GalA蛋白。我们将进一步优化重组蛋白的诱导表达条件，为获得批量的α-GalA并用于临床治疗提供基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
前言  10-13
第一章抗人α—半乳糖苷酶单克隆抗体的制备及应用  13-34
  1.1 实验材料与仪器  13-14
  1.2 实验方法  14-23
    1.2.1 抗原表位分析  14-15
      1.2.1.1 抗原表位分析  14
      1.2.1.2 多肽合成及交联  14-15
    1.2.2 免疫小鼠  15
    1.2.3 杂交瘤细胞制备  15-16
    1.2.4 细胞融合后的筛选与鉴定  16-18
    1.2.5 小鼠单抗腹水的制备及纯化  18-19
    1.2.6 单克隆抗体的性质鉴定  19-21
    1.2.7 单克隆抗体的应用  21-23
  1.3 实验结果  23-30
    1.3.1 合成肽的鉴定结果  23-24
    1.3.2 细胞融合的结果  24
    1.2.3.间接ELISA法筛选结果  24
    1.3.4 亚克隆结果  24
    1.3.5 杂交瘤细胞染色体核型分析  24-25
    1.3.6 杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性分析  25
    1.3.7 单抗亚型的鉴定结果  25-26
    1.3.8 单抗腹水制备及纯化  26-27
    1.3.9 单抗效价的测定  27
    1.3.10 单抗特异性鉴定  27
    1.3.11 单抗亲和力测定  27-28
    1.3.12 间接ELISA及酶活性测定  28-30
  1.4 讨论  30-32
  1.5 小结  32-34
第二章重组人α-半乳糖苷酶A在毕赤酵母中的表达及鉴定  34-49
  2.1 实验材料与仪器  35
  2.2 实验方法  35-40
    2.2.1 人α-半乳糖苷酶A cDNA的克隆  35-37
    2.2.2 人α-半乳糖苷酶A基因表达质粒的构建与分析  37
    2.2.3 电穿孔法转化毕赤酵母GS115菌株  37-38
    2.2.4 重组人α-半乳糖苷酶表达菌株的筛选  38
    2.2.5 重组人α-半乳糖苷酶表达菌株的诱导表达  38-39
    2.2.6 重组人α-半乳糖苷酶表达产物的免疫印迹  39
    2.2.7 重组人α-半乳糖苷酶A活性测定  39-40
  2.3 实验结果  40-47
    2.3.1 人α-半乳糖苷酶cDNA的克隆  40-42
    2.3.2 重组人α-半乳糖苷酶基因真核表达质粒的构建  42-44
    2.3.3 重组人α-半乳糖苷酶A基因转化子的获得  44
    2.3.4 重组人α-半乳糖苷酶表达菌株的筛选  44-45
    2.3.5 重组人α-半乳糖苷酶表达菌株的诱导表达  45
    2.3.6 重组人α-半乳糖苷酶表达产物的免疫印迹  45-46
    2.3.7 重组人α-半乳糖苷酶活性测定  46-47
  2.4 讨论  47-48
  2.5 小结  48-49
总结  49-51
参考文献  51-57
致谢  57-58
附录1、已发表的相关论文  58-59
综述  59-70

诊治法布莱氏病的单抗及重组蛋白的研制

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