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炎性因子OSM诱导乳腺癌恶性演进的分子机制研究

作　者: 郭靓
导　师: 郭宁; 钱露
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: OSM EMT let-7 miR-200 Stat3 Lin-28B
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

炎症在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用，被称为“肿瘤的第七大特征”。炎性微环境中发生的一系列生物化学反应推动肿瘤的恶性转化，上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是肿瘤恶性转化过程中的重要事件。在EMT转化过程中，上皮细胞极性丧失，细胞-细胞及细胞-基质间的粘附减弱，上皮细胞的标志分子E-cadherin下调，间质细胞的标志分子Vimentin、Fibronectin及EMT的关键调控分子ZEB1、Snail、Twist等表达上调。同时，一系列促转移、促侵袭相关基因被诱导，使肿瘤细胞的迁移、侵袭能力增强。炎性微环境中存在大量的炎性因子，已知炎性因子TNF-α、TGF-β、IL-6等参与了EMT过程。抑瘤素（Oncostatin M, OSM）是IL-6家族的重要成员。前期研究提示，在肿瘤细胞培养上清中存在的OSM可能与EMT发生相关。在本研究中，我们通过对乳腺癌组织芯片（n=75）的免疫组化分析，观察到约80%的乳腺癌组织高表达OSM，而乳腺良性疾病及正常乳腺组织中OSM的表达常呈阴性。OSM在乳腺癌组织中以自分泌和旁分泌的形式表达，特别在乳腺癌侵袭前缘，OSM表达呈强阳性，提示OSM可能参与乳腺癌的转移调控。此外，对7种人乳腺癌细胞系的分析亦证实，具有高侵袭能力的MDA-231和MDA-435S细胞表达较高水平的OSM。体外实验结果显示，OSM刺激可诱导上皮型的MCF-7和T47D乳腺癌细胞向间质样细胞转化，E-cadherin下调，Vimentin、Fibronectin以及ZEB1、Snail表达上调，细胞的迁移、侵袭能力显著增强，表明OSM是一个强有力的EMT诱导因子。miRNA在EMT过程中执行重要的功能，其中let-7及miR-200家族成员在EMT中的作用最受关注。在Src诱导的MCF-10A细胞转化过程中，let-7参与NF-κB介导的表观遗传学调控，miR-200可直接抑制E-cadherin的转录抑制子（ZEB1和ZEB2）的表达，ZEB1/miR-200正反馈调控环路在EMT中发挥重要的作用。我们的进一步研究发现，OSM可诱导let-7及miR-200表达下调，但二者呈现独特的变化特征，即let-7表现为瞬时下调，而miR-200的下调则较为滞后而持久。外源性过表达let-7或miR-200mimics，可逆转OSM诱导的EMT发生，使E-cadherin表达得到恢复，并抑制Fibronectin和ZEB1表达，导致细胞的迁移、侵袭能力降低，提示let-7瞬时性下调及miR-200持续性下调在OSM诱导的EMT过程中具有重要的意义。OSM主要激活MEK、JAK/Stat、JNK等信号通路。我们利用MEK通路抑制剂PD98059、JNK通路抑制剂SP600125、JAK/Stat通路抑制剂WP1066预处理MCF-7细胞，发现这些抑制剂可不同程度地抑制OSM诱导的EMT。已知MEK、JNK、JAK2信号通路的激活均可导致Stat3活化。我们的研究证实，OSM刺激可诱导Stat3持续性活化，而敲低Stat3可显著抑制OSM诱导的EMT，并可逆转OSM对let-7和miR-200的下调效应，而过表达组成型激活的Stat3C则可明显下调let-7和miR-200的表达。miRNA主要通过与其靶基因的3’非翻译区（3’UTR）结合而调控靶基因的表达。为了进一步证实Stat3对let-7及miR-200的调控作用，我们分别构建了含let-7和miR-200靶基因HMGA23’UTR及ZEB13’UTR的荧光素酶报告载体，分别用这些载体与Stat3C表达质粒共转染MCF-7细胞。结果显示，过表达Stat3C可明显增强HMGA23’UTR及ZEB13’UTR的活性，而对HMGA25’UTR无影响。敲低Stat3或抑制Stat3信号通路活化均可抑制let-7靶基因HMGA2的表达，进一步表明Stat3对let-7和miR-200的表达具有特异性的调控作用，提示Stat3可能是OSM诱导EMT的关键调控分子，通过调控miRNA表达而影响EMT程序。我们发现，与OSM诱导的let-7瞬时性下调相呼应的是，let-7靶基因HMGA2、c-Myc、Ras均出现瞬时性表达增强，过表达let-7mimics能抑制OSM对HMGA2、c-Myc、Ras的诱导作用。值得注意的是，HMGA2是一个胚胎早期基因，在胚胎发育期高表达于未分化的增殖性细胞，而在成体组织中不表达；let-7的表达恰与之相反，在胚胎阶段难以检测到，而在胚胎发育末期开始上调，提示let-7-HMGA2轴的瞬时变化在OSM诱导的EMT中可能是一个始动效应。我们发现，敲低HMGA2可显著逆转EMT表型，抑制乳腺癌细胞的侵袭能力，并可使OSM诱导的miR-200下调得到恢复，表明let-7和HMGA2的表达动力学变化不仅对于OSM诱导的表观调控具有启动作用，而且对于miR-200的下调亦产生重要的影响。通过对let-7转录本（pri-let-7）及成熟体（mat-let-7）表达的分析，我们发现OSM影响了let-7成熟体的表达，提示Stat3激活可能影响let-7加工成熟。已知RNA结合蛋白Lin-28A和Lin-28B是let-7家族成员加工成熟的关键负调控分子。我们观察到，OSM可诱导Lin-28B的瞬时性表达增强，此表达变化特征与let-7下调的动力学变化一致。敲低Lin-28B表达可显著削弱OSM诱导的EMT效应，揭示了Lin-28B-let-7-HMGA2轴的瞬时激活在OSM诱导的EMT过程中的关键作用。对Lin-28B启动子序列分析显示，Lin-28B启动子序列中含有6个Stat3的潜在结合位点。我们通过ChIP实验证实，外源性及内源性Stat3均能与Lin-28B启动子-2405和-369bp区的Stat3反应元件结合。更为重要的是，在OSM诱导下，内源性Stat3与Lin-28B启动子的结合具有与Lin-28B表达、let-7下调及HMGA2上调相似的时空特征。以上证据证明，OSM诱导的Lin-28B一过性表达增强决定了let-7-HMGA2轴的瞬时开启。为了验证OSM是否可在体内诱导EMT，我们建立了稳定表达GFP的MCF-7/GFP乳腺癌细胞移植瘤模型。当瘤体可触及时，进行瘤体内注射OSM，每周一次，连续6周。60天后处死动物，分离瘤体、肺、肝组织，对瘤组织称重，并作H&E染色和抗GFP抗体免疫组化染色。结果发现，OSM处理明显诱导了乳腺癌自发性肺转移。对瘤组织分析结果显示，OSM处理组的肿瘤组织中E-cadherin表达下调，Vimentin和ZEB1表达上调，Stat3磷酸化水平升高。同时，一系列与转移侵袭相关的基因（MMP-2、MMP-7、MMP-9、COX-2、CXCR-4）均被诱导表达。对瘤组织miRNA分析的结果显示，OSM处理组let-7表达与对照组似无明显差别。但是，OSM注射组的瘤组织中miR-200显著下调。这些结果充分表明，OSM在体内亦具有促EMT效应，并提示OSM诱导的miR-200-ZEB1轴在肿瘤恶性表型的维持过程中发挥重要作用。上述研究结果证实， OSM诱导的EMT受转录因子及miRNA共同构成的复杂网络调控，而Stat3协调、控制并决定了Lin-28B-let-7-HMGA2及miR-200-ZEB1轴的动力学变化，开启并维持乳腺癌EMT过程，赋予乳腺癌细胞明显的间质样表型，促进乳腺癌的恶性进展。我们的研究首次报道了OSM的体内促EMT效应及OSM在乳腺癌恶性演进中的作用；首次揭示了OSM诱导乳腺癌细胞发生EMT的“开关维持”机制；首次报道了Stat3对Lin-28B的转录调控作用。我们的研究成果为炎性微环境诱导肿瘤恶性转化的分子调控网络提供了新信息，为深入探索炎性信号通路在肿瘤发生、发展及转移中的分子机制打下了基础。

全文目录

目录  3-5
缩率词表  5-6
摘要  6-9
Abstract  9-13
前言  13-16
材料与方法  16-25
  1. 材料  16-17
    1.1 细胞株  16
    1.2 菌株与质粒  16
    1.3 细胞因子及主要抗体  16
    1.4 常用试剂/试剂盒  16-17
    1.5 组织切片及动物实验  17
    1.6 主要实验仪器  17
  2. 实验方法  17-25
    2.1 质粒构建  17
    2.2 细胞转染  17-18
    2.3 Western Blot  18
    2.4 RNA 提取、反转录及实时定量 PCR  18-19
    2.5 染色质免疫共沉淀  19-20
    2.6 细胞划痕实验  20
    2.7 侵袭实验  20-21
    2.8 免疫荧光  21
    2.9 免疫组化分析  21
    2.10 双荧光素酶报告载体分析  21-22
    2.11 细胞增殖实验  22
    2.12 动物实验  22-23
    2.13 引物及 siRNA 序列  23-25
结果  25-57
  1. OSM 在乳腺癌组织中高表达  25-27
  2. OSM 高表达与乳腺癌细胞侵袭能力相关  27-28
  3. OSM 在 M2 型巨噬细胞中高表达  28-29
  4. OSM 在不同肿瘤组织中高表达  29-30
  5. OSM 是一个强有力的 EMT 诱导因子  30-33
  6. OSM 促进乳腺癌细胞的迁移、侵袭  33-35
  7. OSM 下调 let-7 和 miR-200 表达  35-37
  8. 过表达 let-7 或 miR-200 逆转 OSM 诱导的 EMT  37-38
  9. 过表达 let-7 或 miR-200 降低细胞迁移、侵袭能力  38-39
  10. 瞬时下调 let-7 在 OSM 诱导 EMT 中的作用  39-40
  11. OSM 诱导 Stat3 持续性活化  40-41
  12. Stat3 是 OSM 诱导 EMT 的关键调控分子  41-42
  13. Stat3 调控 let-7 及 miR-200 表达  42-46
  14. HMGA2 是 OSM 诱导 EMT 的开关分子  46-50
  15. Stat3 抑制 Lin-28B 表达导致 let-7 下调  50-53
  16. 抑制 Lin-28B 表达可逆转 OSM 诱导的 EMT  53-54
  17. OSM 体内促转移及促 EMT 效应  54-57
讨论  57-61
结论  61-62
参考文献  62-68
发表文章  68-87
  综述  68-76
  研究性论文  76-87
个人简历  87-89
致谢  89

炎性因子OSM诱导乳腺癌恶性演进的分子机制研究

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