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一种新的肝癌标记分子的鉴定及其相关功能的初步研究

作　者: 岳树强
导　师: 窦科峰
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学
关键词: LIN-28B 原发性肝癌 肿瘤标记分子 RNA干涉
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,在我国位居肿瘤致死率的第二位,死亡率为20.37/105。目前治疗原发性肝癌的方法很多,包括手术治疗、放疗、化疗和生物治疗。其中以手术切除治疗为最有效的治疗方法。但是,很多病人在诊断为肝癌的时候已经发生了肝内或肝外的远处转移而错过了手术的最好时机。因此,早期诊断原发性肝癌对患者来说至观重要。原发性肝癌的肿瘤标记分子以其方便、廉价、令人满意的准确性被普遍用于恶性肿瘤的筛选。原发性肝癌的肿瘤标记分子可分为四大类:①癌胚抗原和糖蛋白抗原;②酶和同工酶;③细胞因子;④相关基因。虽然上述各种原发性肝癌的肿瘤标记分子在肝癌的诊断中发挥着重要的作用,但是由于它们各自的局限性,都不能单独作为诊断指标去检测原发性肝癌的存在,而必须通过与其他分子的联合应用。为了寻找新的、更为特异的原发性肝癌的肿瘤标记分子,我们实验室早期尝试通过双向电泳和基因芯片的方法对原发性肝癌组织与非肿瘤的肝脏组织相比较,除了找到一些已知的肝癌肿瘤标记分子外(如AFP,VEGF,AFU等),又发现了6个未报道的与肝癌发生密切相关的分子,其中LIN28B基因变化最为明显。研究目的本研究旨在探讨LIN-28B基因在肝癌组织及其癌旁组织,以及其他病因的肝脏正常组织中的表达差异,以便评价该基因作为原发性肝癌的肿瘤标记分子的可行性;进而通过过表达和RNA干涉技术对LIN-28B基因在肝癌发生、发展过程中发挥的功能进行初步的研究,为将来肝癌细胞的治疗提供新的靶点。研究方法首先构建LIN-28B的原核表达载体,诱导表达并纯化融合蛋白后,常规免疫家兔,制备针对LIN-28B蛋白的兔抗人多克隆抗体;接着,运用Real-time PCR的方法检测肝癌组织及癌旁组织和正常组织中LIN-28B在mRNA水平的表达情况,同时应用制备的兔抗人LIN-28B多克隆抗体检测LIN-28B在蛋白质水平的表达情况;最后,构建LIN-28B基因的真核表达载体和干涉载体,分别稳定转染入MCF-7和HepG2细胞中,通过MTT和流式细胞仪分析,观察过表达或封闭LIN-28B基因后对细胞增殖及周期的影响。研究结果成功构建了LIN-28B的原核表达载体,制备并获得了效价为1:64000的特异性兔抗人LIN-28B多克隆抗体。Real-time PCR分析显示,低分化的肝癌组织中LIN-28B的阳性率为100%;中等分化的肝癌组织中该基因的阳性率为71.4%;高分化的肝癌组织中LIN-28B的阳性率只有20%。癌旁组织和正常肝组织中该基因低表达或不表达。Western Blot检测的该基因蛋白质表达情况与mRNA的结果相似。将外源性LIN-28B基因稳转入MCF-7细胞系(无LIN-28B基因表达)后可明显促进该细胞的增殖,而通过封闭HepG2细胞的内源性LIN-28B基因,则可显著降低该细胞的增殖,并伴有细胞G1期的阻滞。结论本研究显示:一方面LIN-28B蛋白的表达随着肝癌恶性程度的增加而逐渐升高,提示该分子有可能作为一种新型的原发性肝癌的肿瘤标记分子,用于对原发性肝癌的恶性程度进行初步的筛选;另一方面LIN-28B基因的促肿瘤细胞增殖的能力,又使该基因成为新的靶位点,为将来原发性肝癌的治疗提供新思路。

全文目录


缩略语表  4-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-12
前言  12-13
文献回顾  13-36
  第一部分：原发性肝癌的研究现状及其治疗方法  13-22
  第二部分：多种肿瘤标志物在原发性肝癌中的诊断  22-33
  第三部分：LIN-288基因的研究现状  33-36
正文  36-80
  第一部分 人LIN-288基因的克隆、表达及抗体制备  36-50
    1. 实验材料和主要仪器  37-38
    2. 实验方法  38-44
      2.1 细胞培养及低氧刺激  38
      2.2 LIN-288基因的扩增  38-40
      2.3 原核表达载体pRSET-A-LIN288的构建  40-41
      2.4 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析  41-42
      2.5 LIN-188蛋白的亲和纯化  42
      2.6 兔抗人LIN-188抗血清的制备  42
      2.7 多克隆抗血清效价的检测  42-43
      2.8 抗体的纯化  43
      2.9 纯化抗体的蛋白印迹验证  43-44
    3. 实验结果  44-48
    4 讨论  48-50
  第二部分 LIN-28B在原发性肝癌组织中的表达分析  50-64
    1. 实验材料和主要仪器  51-52
    2. 实验方法  52-55
      2.1 Real time PCR引物的设计合成  52-53
      2.2 Real time PCR  53-54
      2.3 细胞培养  54
      2.4 Western Blot  54-55
    3. 实验结果  55-62
    4 讨论  62-64
  第三部分 LIN-288在原发性肝癌的发展过程中功能的初步研究  64-80
    1. 实验材料和主要仪器  65-67
    2. 实验方法  67-70
      2.1 真核表达载体的构建  67
      2.2 干涉载体的构建  67-68
      2.3 细胞培养及瞬时转染  68-69
      2.4 Western Blot  69
      2.5 细胞的稳定转染  69
      2.6 MTT法测定细胞生长  69
      2.7 流式细胞仪检测细胞周期变化  69-70
    3. 实验结果  70-77
    4. 讨论  77-80
小结  80-81
参考文献  81-93
个人简历和发表论著  93-95
致谢  95

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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