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转录因子HOXB7在肝癌侵袭转移中的作用及其机制的研究

作　者: 王伟敏
导　师: 樊嘉
学　校: 复旦大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 癌肝细胞同源盒基因 HOXB7 增殖侵袭转移 EMT RNA干扰
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)(简称肝癌)是全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一,在我国每年新诊断的肝癌约占全世界的55%,其死亡率在我国恶性肿瘤中位列第二位。虽然诊断和治疗技术的进步使得肝癌患者的生存率有了较大提高,但术后转移与复发已成为影响肝癌预后的主要障碍,探索肝癌发生发展和转移复发的相关机制以及寻找早期诊断、预测转移复发的生物标记,对其诊断和治疗具有重要的理论指导和临床应用意义。同源盒基因(homeobox gene)是在包括人在内的动物的胚胎发育和细胞分化中发挥重要作用的一类基因。人类Homeobox基因有两大类：Ⅰ类成簇排列(HOX基因),共39个,分HOXA、HOXB、HOXC和HOXD四簇,分别位于7、17、12和2号染色体上；Ⅱ类散在分布,已发现几百个成员。Ⅰ类(HOX基因)分布规律明显,是研究的焦点；其编码蛋白是重要的转录调节因子,调节胚胎发育和生长分化。许多证据显示HOX基因表达紊乱可能在包括肿瘤在内的疾病中发挥重要作用；目前已知其在白血病、黑色素瘤、乳腺癌、口腔癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌等肿瘤中有异常表达,且与肿瘤的分级、分化有关。近年来,多个研究对HOXB7在肿瘤中的作用进行了分析,发现HOXB7在肿瘤细胞的增殖、运动和侵袭中起到重要作用,并且其表达情况与临床病理特征密切相关(癌组织高于正常组织,转移或预后差病例更高)。一般认为,HOXB7通过促进bFGF等生长因子的分泌、参与DNA的修复、介导上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)的发生和促进肿瘤相关血管生成等机制影响肿瘤细胞的生物学行为。HOXB7在黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、口腔癌和结直肠癌等肿瘤中的作用及机制已得到部分阐明；但其在肝癌中的作用尚未揭示,仅有文献报道该基因在正常肝脏组织中不表达,而在25例HCC患者的肿瘤组织中表达较非肿瘤组织中高。本课题旨在通过比较HOXB7在不同转移潜能人肝癌细胞系及12例有、无肝癌复发的组织标本中的表达情况,分析其在由394例有完整的临床和随访资料的组织构建的组织芯片中的表达,用来研究HOXB7在肝癌中的表达情况及其与临床预后的关系；通过靶向HOXB7的小干扰RNA (HOXB7-siRNA)转染HCCLM3或过表达HOXB7的质粒pcDNA3-HOXB7转染MHCC97L,分别在体外、体内探索下调或上调HOXB7基因对HCCLM3或MHCC97L生长及侵袭转移的作用,并根据发现的现象检测代表性的分子(与EMT、侵袭、细胞周期等相关)的表达情况,初步探讨HOXB7在肝癌中的作用机制,可能为肝癌的发生发展和治疗提供新的理论支持。本课题分为三部分：1、HOXB7在不同转移潜能人肝癌细胞系及有、无复发肝癌组织中的表达情况；2、HOXB7对人肝癌细胞系生物学功能的影响及相关机制的研究；3、HOXB7在肝癌组织中的表达及其与肝癌临床病理特征和预后的关系。第一部分HOXB7在不同转移潜能人肝癌细胞系及有、无复发肝癌组织中的表达情况目的：观察不同转移潜能的人肝癌细胞系(HepG2、MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3)及有、无复发的肝癌组织中HOXB7的表达情况,初步探讨HOXB7表达在肝癌中的意义。方法：应用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光和免疫细胞化学方法检测HOXB7在不同转移潜能人肝癌细胞系的表达情况。应用Western blot方法检测HOXB7在12例5年内有肝癌复发与12例5年内无肝癌复发患者的肝癌组织中的表达差异。结果：在不同的肝癌细胞系中的HOXB7 mRNA及蛋白质水平随着肝癌细胞系侵袭转移潜能的增强而显著升高(p<0.05), HOXB7主要定位于癌细胞的核内；HOXB7在有复发患者的肝癌组织中表达较高(p<0.001)。结论：在不同转移潜能的人肝癌细胞系及有、无复发的肝癌组织中HOXB7表达有显著差异,其可能参与肝癌的发展及侵袭与转移。第二部分HOXB7对人肝癌细胞系生物学功能的影响及相关机制的研究目的：研究下调或上调HOXB7的表达对肝癌细胞生物学功能的影响,并初步探索其机制。方法：采用siRNA介导的RNA干扰技术对人肝癌细胞系HCCLM3中HOXB7进行1nRNA水平上的基因沉默。然后分别用CCK8实验、划痕实验、黏附实验、Transwell实验和Annexin V/PI染色联合流式细胞仪检测HOXB7被下调后HCCLM3细胞增殖、迁移、黏附、运动、侵袭和凋亡、细胞周期的改变。应用pcDNA3-HOXB7质粒稳定转染MHCC97L,观察过表达HOXB7后的MHCC97L细胞形态的变化、分泌bFGF量的改变、对增殖的影响及在裸鼠体内生长和肺转移的情况。应用实时荧光定量PCR和/或Western blot方法和/或免疫荧光检测HOXB7的改变及改变后上皮间质转化(EMT)主要标志分子(E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白)、MMP2、细胞周期基因(CyclinD1和Cyclin E)的变化。结果：RNA干扰后,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,HCCLM3细胞中HOXB7的表达被有效抑制,抑制率达80%以上。siRNA抑制HOXB7后,HCCLM3细胞的增殖(p<0.01)、迁移(p<0.001)、黏附(p<0.01)、运动(p<0.05)和侵袭(p<0.05)能力显著降低；凋亡情况未见改变(p>0.05)；细胞周期停滞在G0-G1期,S期所占比例明显减少(p<0.05)。过表达HOXB7后,MHCC97L细胞变的细长呈梭形,分泌bFGF能力增强(p<0.001),增殖加快(p<0.01),体内成瘤生长能力明显增强(p<0.01),肺转移灶数目明显增加(p<0.001)。检测到HOXB7改变后E-钙黏蛋白与HOXB7的表达呈负相关,N-钙黏蛋白、波形蛋白、MMP2、CyclinD1和Cyclin E与HOXB7的表达呈正相关。结论：HOXB7可能通过刺激人肝癌细胞分泌bFGF、推进细胞周期进程、介导EMT的发生、促进MMP2表达,对人肝癌细胞的增殖、迁移、黏附、运动、侵袭与转移能力起到支持作用。第三部分HOXB7在人肝癌组织中的表达情况及其与肝癌临床病理特征和预后的关系目的：研究HOXB7在原发性肝细胞肝癌患者的肝癌及相应癌旁组织中的表达情况,探讨其与肝细胞肝癌临床病理特征和预后的关系。方法：应用免疫组化方法检测394例肝细胞肝癌组织构建的组织芯片中HOXB7蛋白的表达情况,SPSS16.0统计分析其与肝细胞肝癌临床病理特征及预后的关系。结果：HOXB7蛋白主要表达在肝癌组织中,相应癌旁组织中的表达较少。肝癌组织中HOXB7蛋白的过表达与肝癌患者的伴有肝硬化、多个肿瘤、有血管侵犯、有卫星病灶、高BCLC分期和高TNM分期等临床病理因素有明显关联(p<0.05)。HOXB7表达阳性组的8年总体生存率及无复发生存率明显低于HOXB7阴性组(p<0.05),分层Kaplan-Meier分析显示在无血管侵犯、无卫星病灶、低TNM分期、低AFP水平、分化较差组的肝癌组织中,过表达HOXB7患者OS和RFS均较低表达组差(p<0.05)。多因素分析表明有肝硬化、多个肿瘤、有血管侵犯、HOXB7高表达为影响患者OS和RFS的共同的独立预后因素；APF水平较高和肿瘤直径>5cm为影响OS的独立预后因素。结论：HOXB7高表达与肝细胞肝癌的侵袭、转移及不良预后相关。创新点1.初步探索HOXB7对人肝癌细胞体外及体内功能的影响及可能作用机制：提不HOXB7促进肝癌侵袭转移作用的部分机制可能与促进EMT的发生、bFGF的分泌和MMP2的表达有关。2.首次大批量检测HOXB7在肝癌组织和对应癌旁组织中表达情况,并分析其临床病理意义,评价其作为肝癌预后分子标记物的可能性。潜在应用价值1. HOXB7是一个潜在的肝癌诊断分子和转移复发的治疗靶点。2.为深入研究肝癌发生和转移过程中HOXB7参与肝癌侵袭转移的机制提供实验基础。

转录因子HOXB7在肝癌侵袭转移中的作用及其机制的研究

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