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Gal-9/Tim-3通路介导免疫调节的机制研究

作　者: 李育蓉
导　师: 黎燕
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: 半乳凝素-9 Tim-3 免疫调节自身免疫性糖尿病败血症
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

半乳凝素-9(Galectin-9/Gal-9)属于半乳凝素家族成员。大量文献研究证实,Gal-9可通过与Th1、Th17细胞上的Tim-3结合,诱导上述T效应细胞的凋亡或抑制其分化,下调免疫反应,诱导免疫耐受[1-3]。基于Gal-9在上述免疫耐受诱导中的作用,该分子被认为是自身免疫性疾病的一个潜在干预靶点。随着研究的深入,人们发现其受体Tim-3也表达在DC、单核、巨噬细胞等炎症细胞上。Gal-9也可与表达在DC等炎症细胞上的Tim-3结合,并通过诱导后者的活化增强炎症及免疫反应[4],上述研究提示Gal-9/Tim-3通路在特异性免疫及天然免疫中介导相反的作用,其具体机制尚不清楚。结构决定功能。Gal-9在半乳凝素家族中属于串联重复型:由2个糖识别结构域(Carbohydrate Recognition Domain, CRD)串联融合而成。然而Gal-9的N端和C端结构域存在许多不同之处,如氨基酸序列、与寡聚糖的亲和力[5]等。两个CRD氨基酸序列的区别表明这两个结构域可能在Gal-9介导生物学功能时起到不同的作用,且有研究表明Gal-9-N、Gal-9-C两个结构域可分别独立的发挥作用。因此我们提出的假设是Gal-9通过不同的结构域在不同的细胞上介导不同的功能。为了验证上述假设,我们首先运用计算机模建的方法,模拟小鼠Gal-9-N、Gal-9-C和Tim-3的空间结构,并对Gal-9的N端、C端与Tim-3作用模式进行了理论预测。理论预测的结果表明Gal-9的N端和C端都可以与Tim-3结合形成稳定构象。尽管小鼠Gal-9的N端、C端无论序列、结构,其相似性程度较高,且同为半乳凝素的关键结构域,然而其与Tim-3的相互作用存在差异,Tim-3的识别区域、相互作用能等均不同。理论预测结果提示Gal-9的N端和C端可独立结合Tim-3,且可能介导不同的功能,但仍需要进一步的生物学功能实验来证明。所以在接下来的研究中我们利用分子生物学技术钓取小鼠Gal-9-N、Gal-9-C和Gal-9-NC(除去中间肽段)基因。由于文献报道Gal-9N端与C端同源二聚或异源二聚结构是Gal-9发挥功能所必需的[6]。所以我们表达了Gal-9缺失突变体与人源Fc融合蛋白:Gal-9-N-Fc、Gal-9-C-Fc,以及重组Gal-9-NC蛋白,从而使其形成二聚结构。通过SDS-PAGE和Western blot方法检测蛋白的纯度以及验证其特异性。我们利用小鼠T细胞(EL-4)和DC细胞(DC2.4)进行功能试验,体外验证了N、C端在诱导T细胞凋亡及活化DC细胞中确实存在差异,Gal-9的C端是其诱导T细胞凋亡的关键结构域,而N端则是其活化天然免疫细胞(DC、巨噬细胞)的关键结构域。在前期研究证实Gal-9-N、Gal-9-C可以介导不同功能的基础上,我们随后探讨了Gal-9-N、Gal-9-C激活Gal-9/Tim-3通路或用Tim-3重组蛋白阻断Gal-9/Tim-3通路对疾病模型的影响。免疫效应细胞尤其是CD4+ Th1、Th17细胞的异常活化、释放大量炎症介质是导致器官特异性自身免疫病发病的关键因素。在自身免疫性糖尿病小鼠模型中[7],Th1细胞是介导糖尿病发生的重要因素,Gal-9可以通过诱导Th1效应细胞的凋亡而有效降低糖尿病的发病率。所以本课题以自身免疫性糖尿病NOD小鼠为动物模型,Gal-9N、C端的重组融合蛋白为干预蛋白,激活Gal-9/Tim-3通路,检测了Gal-9-N和Gal-9-C在预防糖尿病中的差异,初步结果提示Gal-9-N和Gal-9-C都能够有效预防自身免疫性糖尿病,具体的机制尚需要进一步的探讨。如前所述,Gal-9分子广泛参与了机体的天然免疫及获得性免疫反应的调节过程,而败血症(sepsis)的是一种涉及复杂天然及获得性免疫紊乱的免疫疾病,为了探讨Gal-9是否也参与了败血症的免疫调节,我们建立了小鼠CLP动物模型,表达了它的受体蛋白Tim-3。参考文献的方法以游离的重组Tim-3融合蛋白体内阻断Gal-9/Tim-3通路,观测了Gal-9/Tim-3通路阻断后败血症的模型小鼠生存率变化,检测胸腺细胞凋亡情况以及细胞因子在外周血、腹腔灌洗液、脾脏、肠系膜淋巴节中的分泌情况。结果表明重组Tim-3阻断Gal-9/Tim-3通路后,胸腺细胞凋亡增多,败血症加重,生存率下降,炎症因子IL-6表达上调;保护性因子IL-12的表达在外周血、脾淋巴细胞和肠系膜淋巴节中都下降。这提示Gal-9/Tim-3通路参与了败血症的免疫调节,且发挥免疫自稳作用,即激活这条通路可能会减轻败血症病情,对机体起到保护作用。综上所述, Gal-9的N端和C端在诱导T细胞凋亡和活化DC等天然免疫细胞上发挥不同作用,N端倾向于活化DC、巨噬细胞等天然免疫细胞,而C端更倾向于诱导T细胞凋亡。体内试验提示,Gal-9/Tim-3通路在诱导糖尿病免疫耐受及维持败血症的免疫稳定中发挥重要作用。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
前言  10-13
第一章 (计算机模建部分) Gal-9 与Tim-3 作用复合物的计算机模拟  13-24
  第一节小鼠Tim-3 空间结构模拟  13-16
    1 材料与方法  13-14
    2 结果  14-16
    3 讨论  16
  第二节小鼠Gal-9 序列信息及空间结构模拟  16-21
    1 材料与方法  16
    2 结果  16-20
    3 讨论  20-21
  第三节小鼠Gal-9 的N 端、C 端与Tim-3 作用模式理论预测  21-23
    1 材料与方法  21
    2 结果  21-23
    3 讨论  23
  小结  23-24
第二章重组Gal-9 突变体蛋白的克隆、表达和鉴定  24-34
  1 材料和方法  24-28
  2 结果  28-33
  3 讨论  33
  小结  33-34
第三章 Gal-9 的N 端和C 端功能差别分析  34-45
  1 材料和方法  34-36
  2 结果  36-42
  3 讨论  42-44
  小结  44-45
第四章 Gal-9/Tim-3 通路的体内免疫调节功能研究  45-66
  第一节 Gal-9/Tim-3 通路在自身免疫性糖尿病模型中的调节作用研究  45-54
    1 材料和方法  45-49
    2 结果  49-53
    3 讨论  53-54
  第二节 Gal-9/Tim-3 通路在败血症模型中的调节作用研究  54-66
    1 材料和方法  55-57
    2 结果  57-64
    3 讨论  64-66
  小结  66
结论  66-67
参考文献  67-72
附录  72-74
文献综述  74-83
  参考文献  80-83
发表论著  83-90
个人简历  90
攻读硕士期间科研成果  90-92
致谢  92

Gal-9/Tim-3通路介导免疫调节的机制研究

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