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小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备

作　者: 马德强
导　师: 杨东亮；陈悦
学　校: 华中科技大学
专　业: 内科学
关键词: TIM-3 蛋白多克隆抗体
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 31次
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内容摘要

目的1.克隆小鼠的TIM-3基因,建立原核表达载体。2.原核表达该分子,制备相应的多克隆抗体并初步鉴定。方法1.以BALB/c小鼠的脾细胞总RNA为模板,应用RT-PCR方法,扩增得到TIM-3的胞外段序列,与pRSET-B载体连接。2.将pRSET-B-TIM-3质粒转入表达菌Roseeta(DE3)中,用IPTG诱导表达,利用western blot方法检测重组蛋白的抗原性。通过Ni-NTA柱的方法纯化重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA、western blot,免疫组化和流式细胞术等方法检测抗体的效价与特异性。结果1.使用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠的脾细胞总RNA中扩增得到约510bp的TIM-3基因的胞外段,与pRSET-B载体连接,对重组体进行PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析表明:成功构建了原核表达载体pRSET-B-TIM-3。2.重组质粒的TIM-3蛋白在Rosseta(DE3)中经过IPTG诱导,以包涵体的形式高效表达。通过western blot分析,证实了约25KD的目的蛋白。3.用Ni-NTA镍柱纯化重组的TIM-3蛋白常规免疫家兔,得到了特异性的高效价的多克隆抗体,经过ELISA检测,抗体的效价为1:320000,经过western blot,免疫组化和流式细胞术鉴定,抗体的特异性较好。结论1.成功构建了TIM-3胞外段的原核表达载体pRSET-B-TIM-3,并且在Rosseta(DE3)表达系统中可以以包涵体的形式高效表达。2.纯化的TIM-3重组蛋白具有良好的免疫原性,成功制备出高效价的多克隆抗体。本研究的意义本研究建立小鼠TIM-3的原核表达载体并制备抗小鼠TIM-3的多克隆抗体,可用于小鼠模型的TIM-3的体外检测和体内阻断实验,对于进一步研究TIM-3在急慢性病毒感染中的作用及机制有重要的意义。

全文目录

第一部分小鼠TIM-3 原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备  5-60
  英汉词汇对照表  5-6
  中文摘要  6-8
  英文摘要  8-10
  引言  10-12
  材料和方法  12-34
  结果  34-47
  讨论  47-50
  参考文献  50-52
  综述  52-60
    参考文献  57-60
第二部分临床病人随访资料计算机管理软件（数据库）设计和开发  60-70
  一.引言  60-61
  二.数据库设计的基本理念  61
  三.数据库的技术特点  61-62
  四.数据库的构成  62-63
  五.数据库的建立与应用  63-69
  六.数据库存在问题与改进建议  69
  七.小结  69-70
致谢  70

小鼠TIM-3原核表达载体的建立及多克隆抗体的制备

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