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MDCK细胞培养的甲型H1N1流感病毒疫苗研究

作　者: 姚志东
导　师: 王希良
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 免疫学
关键词: MDCK细胞单克隆细胞株甲型H1N1流感病毒裂解疫苗免疫评价
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

流行性感冒简称流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感的发病率为各种传染性疾病之首,是严重危害人类健康的重要传染病之一。据2011年世界卫生组织报告,全球每年约有6亿～l2亿人感染流感,其中死亡50万～100万人。甲型流感病毒常引起世界性流感大流行,对人类威胁极大。众所周知,上世纪爆发的“西班牙流感”、“亚洲流感”、“香港流感”三次大流感流行,分别由甲型H1N1、甲型H2N2和甲型H3N2亚型流感病毒引起,造成了数千万人死亡,给人类健康和经济造成了巨大危害和损失。随着全球气候和生态环境变化,流感对人类健康和公共卫生安全危害日益严重,特别是近年来人感染高致病性H5N1禽流感,以及2009年在墨西哥爆发的甲型H1N1流感,再一次给人们敲响了警钟,人类流感的防控极其重要。接种疫苗是防控流感爆发最经济、有效的手段。目前,流感疫苗主要的生产介质是鸡胚,然而鸡胚来源的疫苗存在着质量难以控制、生产周期长、易引起过敏,一旦流感爆发其来源将成为瓶颈,无法及时应对流感疫情等问题。因此,开发新的人用流感疫苗生产介质已成为疫苗生产的关键,WHO推荐细胞是生产疫苗的优良介质。采用细胞进行流感疫苗的发酵生产,其质量可控性好,封闭的生产体系方便安全,可以根据需求大批量发酵生产,避免了由于流感大流行造成鸡胚供应不足而影响疫苗产量的缺点。目前,获准生产人用流感疫苗的细胞系主要有Vero细胞和MDCK细胞。据报道,已有企业利用Vero细胞和MDCK细胞通过微载体系统进行发酵生产制备人用流感疫苗。Baxter公司已经于2009年通过Vero细胞技术平台生产了禽流感疫苗CELVAPAN并上市,Novartis公司于2007年用MDCK细胞生产了流感疫苗Optaflu并上市,同时Novartis公司于2009年又通过细胞培养技术生产了甲型H1N1流感疫苗。采用细胞进行流感疫苗的制备,存在的主要问题是流感病毒产量低。人流感病毒主要通过结合到细胞表面的唾液酸寡糖上进行吸附感染,该唾液酸寡糖类型是N-乙酰唾液酸末端通过α2,6糖苷键连接到半乳糖上的(NeuAcα2,6 Gal)。虽然MDCK细胞和Vero细胞表面都有这种类型的唾液酸寡糖,但是丰度并不高。同时,细胞表面流感病毒受体的类型和数量存在着个体差异。另外,流感病毒在不同的细胞内复制效率的高低也可能存在着个体化差异。所以可以通过筛选单克隆细胞株的方法来获得流感病毒适应性细胞。由于MDCK细胞对流感病毒的适应性要好于Vero细胞,所以可以筛选MDCK单克隆细胞株来获得对流感病毒高产的细胞株,以实现流感病毒在哺乳动物细胞中能够高效复制扩增的目的。为了实现利用细胞代替鸡胚来生产制备流感疫苗的目的,我们筛选获得能够产生较高病毒滴度的细胞株和病毒株,进而优化细胞和病毒培养条件,并进行大规模生产制备流感疫苗。我们通过两方面进行筛选:第一,通过有限稀释法制备单克隆细胞株,使用流感病毒进行感染,从而筛选出适应流感病毒的单克隆细胞株;第二,筛选流感病毒株,用不同的流感病毒株感染单克隆MDCK细胞株,筛选出可以产生较高病毒滴度的流感病毒株。通过以上两方面的筛选,获得能够产生较高病毒滴度的细胞株和病毒株,并进一步经培养条件优化,扩大培养,为使用哺乳动物细胞进行大规模生产制备流感疫苗奠定基础,为流感爆发,能够及时大规模生产制备流感疫苗提供了技术保证,因此具有重大意义。本课题的研究目的主要是通过有限稀释法制备单克隆细胞株,筛选出适应流感病毒高滴度复制的单克隆细胞株;用不同的流感病毒株感染单克隆细胞株,筛选出能产生较高病毒滴度的流感病毒株;将筛选获得的单克隆细胞株和流感病毒株进行条件优化,扩大培养,从而制备流感疫苗,为细胞代替鸡胚大规模生产制备流感疫苗奠定基础。本研究主要包括以下三个部分:第一、甲型H1N1流感病毒株和MDCK单克隆细胞株的筛选、鉴定及培养条件优化。通过有限稀释法制备MDCK单克隆细胞株,建立MDCK单克隆细胞库。使用不同的甲型H1N1流感病毒株感染MDCK单克隆细胞株,通过血凝滴度检测筛选出能够产生较高病毒滴度的细胞株和病毒株。经筛选后获得能产生较高病毒滴度的细胞株和病毒株分别为M77单克隆细胞株和甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009。对筛选到的细胞株和病毒株进行TCID50滴度测定、空斑形成试验、细胞表面NeuAcα2,6 Gal丰度测定、细胞株遗传稳定性等检测。结果显示,M77细胞株较普通MDCK细胞能显著提高流感病毒滴度。将筛选到的细胞株建立MDCK细胞库并进行细胞库检定,将筛选到的病毒株建立甲型H1N1流感病毒库并进行病毒库检定,均符合要求。然后对病毒培养条件,包括细胞丰度、病毒稀释液、病毒感染剂量(MOI)、培养温度、病毒收获时间等进行优化。优化的最佳培养条件为:接种病毒时细胞丰度选择100%,采用无血清的DMEM培养基(含1μg/ml的TPCK-胰酶),MOI选择0.001,培养温度选择37℃,病毒收获时间选择感染后72h～96h。以上条件优化,为甲型H1N1流感病毒的扩大培养提供了技术保证。第二、甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞上的扩大培养、浓缩纯化及检测鉴定。将筛选到的甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009感染筛选到的MDCK单克隆细胞株M77,采用优化了的较佳培养条件,依次在细胞培养瓶、细胞工厂和发酵罐中进行扩大培养,结果都较理想。将扩大培养收集的病毒收获液通过1: 4000的甲醛灭活、10KD的膜包浓缩、30%与60%的蔗糖密度梯度离心纯化、0.5%的Triton X-100裂解,并对纯化前后的甲型H1N1病毒样品进行电镜观察、血凝滴度、总蛋白含量、HA抗原含量、DNA残留量等进行测定。结果显示,经MDCK细胞培养的甲型H1N1流感病毒具典型流感病毒特征,纯度达到98.3235%,杂蛋白去除率为98.30%,HA的回收率为40%,经处理后DNA残留量低于100 pg/剂。第三、细胞培养的甲型H1N1流感裂解疫苗的免疫效果评价。将由MDCK细胞培养的甲型H1N1流感病毒进行纯化后,制备成甲型H1N1流感裂解疫苗。将6周龄的雌性Balb/c小鼠随机分组,每组12只,分为PBS对照组、鸡胚来源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫组和细胞来源甲型H1N1流感裂解疫苗免疫组。每只小鼠肌肉注射接种HA抗原15μg,注射量为200μl/只。第一次免疫后两周进行第二次加强免疫。分别在一免一周、一免二周、二免一周和二免二周对小鼠进行尾静脉采血,检测其血清中抗体IgG,IgG1,IgG 2a以及IgG 2b的滴度和HI滴度,并且检测其血清中细胞因子IL-4和IFN-γ的滴度以及小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IL-4和IFN-γ的细胞频数水平。用甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009和病毒株A/PR/8/34对二免二周的小鼠进行滴鼻攻毒实验,评价细胞培养的甲型H1N1流感裂解疫苗对小鼠的免疫保护性及交叉保护性。结果显示,细胞培养的甲型H1N1流感裂解疫苗与鸡胚培养的甲型H1N1流感裂解疫苗都能激活较高的体液免疫水平,且细胞培养的甲型H1N1流感裂解疫苗比鸡胚培养的甲型H1N1流感裂解疫苗要更高。细胞培养的甲型H1N1流感裂解疫苗和鸡胚培养的甲型H1N1流感裂解疫苗对小鼠的免疫保护性都能达到100%。交叉保护性实验显示,细胞培养的甲型H1N1流感裂解疫苗比鸡胚来源的流感裂解疫苗具有更好的交叉保护性。结论:采用单克隆细胞株筛选的方法可以获得能够产生较高病毒滴度的细胞株,经病毒培养条件优化后扩大培养,可以获得理想的病毒产量。经动物实验证实细胞培养的甲型H1N1流感疫苗具有很好的免疫效果、较高的免疫保护性及交叉保护性。为发展MDCK细胞规模化生产流感疫苗奠定了基础。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
前言  14-18
第一部分甲型 H1N1 流感病毒株和MDCK 单克隆细胞株的筛选、鉴定及培养条件优化  18-55
  材料与方法  19-35
  结果  35-52
  讨论  52-54
  小结  54-55
第二部分甲型 H1N1 流感病毒在MDCK 细胞上的扩大培养、浓缩纯化及检定  55-71
  材料与方法  55-63
  结果  63-68
  讨论  68-69
  小结  69-71
第三部分 MDCK 细胞培养的甲型 H1N1 流感裂解疫苗的免疫效果评价  71-87
  材料与方法  71-77
  结果  77-84
  讨论  84-86
  小结  86-87
参考文献  87-91
全文总结  91-92
文献综述  92-103
  参考文献  98-103
实验文章  103-113
个人简历  113-114
致谢  114-115

MDCK细胞培养的甲型H1N1流感病毒疫苗研究

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