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PRRSV recCH-1R嵌合病毒构建及PRRS和CSF活疫苗细胞免疫评价

作　者: 汪志艳
导　师: 蔡雪辉
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒2型 PRRSV rCH-1R感染性克隆荧光定量PCR 细胞免疫评价 IFN-γ IL-2 TNF-α
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是一种主要以妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪严重的呼吸道症状为主要特征的传染病。PRRS自暴发以来，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。该病的病原体-猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV），属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，为有囊膜的单股正链RNA病毒。本实验室成功构建了CH-1R致弱毒株（CH-1a传代第171代）的全长cDNA分子克隆rCH-1R，并获得了该克隆的拯救病毒-recCH-1R。在本研究中，将PCV2-Cap基因插入到rCH-1R的ORF1b和ORF2a之间；然后，分别用高致病性PRRSVHuN4株的GP5基因和GP5+M基因替换rCH-1R株的相应基因，最终成功获得了3株嵌合病毒：recCH-1R-PCV2-Cap、recCH-1R-HuN4-GP5和recCH-1R-HuN4-GP5+M。通过RT-PCR检测、细胞病变观察、间接免疫荧光试验、电镜观察和一步生长曲线等方法鉴定所获得的3株嵌合病毒的生物学特性，结果表明嵌合病毒recCH-1R-PCV2-Cap的CPE、病毒粒子形态以及增殖等生物学特性与亲本病毒recCH-1R相似，间接免疫荧光试验证明嵌合病毒recCH-1R-PCV2-Cap能与PRRSV阳性血清和PCV2-Cap单抗发生反应；嵌合病毒recCH-1R-HuN4-GP5和recCH-1R-HuN4-GP5+M和亲本病毒相比，只有CPE形态有所改变，表现为聚堆、脱落，证明成功地拯救了3株嵌合病毒。在体外Marc-145细胞传代中，嵌合病毒recCH-1R-PCV2-Cap中PCV2Cap基因出现不同的缺失，而嵌合病毒recCH-1R-HuN4-GP5和recCH-1R-HuN4-GP5+M分别从第8代和第16代开始发生回复突变，替换的HuN4GP5蛋白和GP5+M蛋白的氨基酸序列均突变回recCH-1R株相应蛋白的氨基酸序列，显示PRRSVrecCH-1R株具有较强的自我修复的作用。本研究建立了猪全血中细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-αTaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，该方法在101～108拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系，相关系数R2为0.999。利用该方法对猪瘟（CSF）活疫苗、PRRSCH-1R活疫苗和PRRSVrecCH-1R株免疫仔猪后的细胞免疫水平进行了评价。研究结果显示：①CSF疫苗免疫组CSFV刺激全血细胞相对于空白对照全血细胞，IFN-γ、IL-2和TNF-αmRNA水平在免疫后3～10d之间均显著升高（p＜0.05），IFN-γmRNA在14d仍保持高水平表达；对照组细胞CSFV刺激细胞和空白对照细胞的3种细胞因子mRNA水平无明显差异（p＞0.05）；CSF活疫苗免疫之后CD4+CD8+细胞比例逐渐上升，表明CSF活疫苗免疫猪只后，能够诱导细胞免疫应答。②PRRSCH-1R活疫苗和PRRSVrecCH-1R株免疫组的PRRSV刺激全血细胞相对于空白对照全血细胞，IL-2mRNA表达量在免疫后7d和28d均显著升高（p＜0.05），而在14d均显著降低（p＜0.05）；TNF-αmRNA表达量在免疫后3～28d均显著升高（p＜0.05），除了第14d；但是只有个别样品能检测出IFN-γmRNA表达水平；PRRSVCH-1R活疫苗和PRRSVrecCH-1R株免疫后，CD4~+CD8~+比例逐渐上升，而CD4~+CD8~-细胞比例逐渐下降，说明recCH-1R和CH-1R活疫苗均能诱导机体产生细胞免疫反应。以上实验结果表明，TNF-α、IL-2可以作为细胞免疫评价的指标之一。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章引言  15-30
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）反向遗传学相关研究进展  15-24
    1.1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述  15-21
    1.1.2 PRRSV的反向遗传学研究进展  21-22
    1.1.3 PRRSV的免疫学与疫苗研究进展  22-23
    1.1.4 猪圆环病毒概况  23-24
  1.2 细胞免疫评价相关研究进展  24-29
    1.2.1 IFN-γ、IL-2、TNF-α概述  24-26
    1.2.2 细胞免疫评价方法  26-28
    1.2.3 猪瘟（CSF）概述  28-29
  1.3 研究目的和意义  29-30
第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒recCH-1R嵌合病毒的构建  30-54
  2.1 材料和方法  30-40
    2.1.1 质粒、细胞、毒株、抗体  30
    2.1.2 主要试剂和仪器  30
    2.1.3 引物的设计和合成  30-32
    2.1.4 构建重组质粒V76-1b-PCV2-Cap-2a、V76-1b-HuN4-GP5-2a和V76-1b-HuN4-GP5+M-2a  32-35
    2.1.5 重组质粒rCH-1R-PCV2-Cap、rCH-1R-HuN4-GP5和rCH-1R-HuN4-GP5+M的构建  35-37
    2.1.6 嵌合病毒的构建  37-40
  2.2 结果  40-51
    2.2.1 PCR扩增相应片段  40-41
    2.2.2 重组质粒pEASY-1b-PCV2-Cap-2a、pEASY-F5-HuN4-GP5-2a和pEASY-F5-HuN4-GP5+M-2a的测序鉴定  41-42
    2.2.3 重组质粒rCH-1R-PCV2-Cap、rCH-1R-HuN4-GP5和rCH-1R-HuN4-GP5+M的构建  42-44
    2.2.4 嵌合病毒的构建  44-51
  2.3 讨论  51-54
第三章 PRRS和CSF活疫苗的细胞免疫评价  54-71
  3.1 材料和方法  54-60
    3.1.1 猪细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-αTaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立  54-56
    3.1.2 IFN-γ、IL-2、TNF-αqRT-PCR方法对猪瘟活疫苗的细胞免疫评价  56-58
    3.1.3 IFN-γ、IL-2、TNF-αqRT-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征CH-1R活疫苗和PRRSVrecCH-1R株的细胞免疫评价  58-60
  3.2 结果  60-68
    3.2.1 猪细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-αTaqMan定量RT-PCR方法的建立结果  60-63
    3.2.2 IFN-γ、IL-2、TNF-αqRT-PCR对CSF活疫苗的细胞免疫评价实验结果  63-66
    3.2.3 IFN-γ、IL-2、TNF-αqRT-PCR对PRRSCH-1R活疫苗和PRRSVrecCH-1R株的细胞免疫评价实验结果  66-68
  3.3 讨论  68-71
第四章结论  71-72
参考文献  72-88
致谢  88-89
作者简介  89

PRRSV recCH-1R嵌合病毒构建及PRRS和CSF活疫苗细胞免疫评价

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