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流感病毒检测新技术的建立及初步应用研究

作　者: 秦萌
导　师: 马学军
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 病原生物学
关键词: 新甲型H1N1流感病毒 多重RT-PCR GeXP system 实时定量RT-PCR 环介导的逆转录等温扩增
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：建立和评价两种基于实验室的同时检测新甲型流感病毒和季节性流感病毒的多重RT-PCR方法；建立和评价一种基于现场的快速诊断新甲型H1N1流感病毒的等温扩增技术。方法：(一)利用GeXP system建立多重RT-PCR方法1.从NCBI网站的GenBank数据库中下载所有甲型流感病毒的Matrix(M)基因、所有甲型流感病毒H1N1亚型的血凝素(HA)基因、季节性H1N1流感病毒多的血凝素(HA)基因、季节性H3N2流感病毒的血凝素(HA)基因、2009年流行的新甲型H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因的核苷酸序列,利用GeXP eXpress Profiler分别设计针对上述各基因的特异性引物。利用人的RNaseP基因做为内参判断标本来源和实施质量控制的依据；同时利用Kan(?)RNA做为内参判断扩增体系是否正常。2.建立8重RT-PCR方法同时检测新甲型流感病毒和季节性流感病毒,对其进行方法学评价(包括灵敏度、特异性等),并与WHO推荐的rRT-PCR鉴定结果进行比较。(二)利用CFX96real-time system建立4重rRT-PCR方法1.从NCBI网站的GenBank数据库中下载季节性H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因、季节性H3N2流感病毒的血凝素(HA)基因、2009年流行的新甲型H1N1流感病毒的血凝素(HA)基因的核苷酸序列,利用Primer Premier5分别设计针对上述各基因的特异性引物和探针。利用人的RNaseP基因做为内参判断标本来源和实施质量控制的依据。2.建立4重rRT-PCR方法检测新甲型流感病毒和季节性流感病毒,对其进行方法学(包括特异性、灵敏度等)评价,并与WHO推荐的rRT-PCR方法的鉴定结果进行比较。(三)建立环介导的逆转录等温扩增技术1、选择人甲型H1N1流感HA基因(GenBank:FJ966974.1)设计相应的RT-LAMP引物。2、建立RT-LAMP特异性检测新甲型流感病毒的方法,对其进行方法学(包括特异性、灵敏度等)评价,WHO推荐的rRT-PCR方法的鉴定结果进行比较。结果：1.利用GeXP system建立的8重RT-PCR方法检测新甲型流感病毒的灵敏度达到10copies RNA。通过对不同来源的流感病毒的验证,结果表明每对引物均未见交叉反应,特异性较好。通过对29份新甲型流感疑似患者的咽拭子标本进行检测,GeXP多重RT-PCR的阳性率为97%,明显高于WHO推荐的rRT-PCR方法(76%)(P<0.05)。2.利用CFX96建立的4重rRT-PCR方法检测新甲型流感病毒的灵敏度达到20copies RNA。通过对不同来源的流感病毒的验证,结果表明每对引物均未见交叉反应,特异性较好。通过对29份新甲型流感疑似患者的咽拭子标本进行检测,CFX96的多重rRT-PCR阳性率为93%,高于WHO推荐的rRT-PCR方法(76%)(P<0.05)。3.利用RT-LAMP检测新甲型流感病毒的灵敏度达到60copies RNA。通过对不同来源的流感病毒的验证,结果表明此法特异性高。通过对29份新甲型流感疑似患者的咽拭子标本进行检测,RT-LAMP阳性率为90%,高于WHO推荐的rRT-PCR方法(76%)(P<0.05)。结论：成功建立两种多重RT-PCR同时检测新甲型流感病毒和季节性流感病毒的新技术和一种基于现场的快速准确易推广的检测新甲型流感病毒的等温扩增技术,有助于提高我国流感监测网络实验室的检测能力。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）
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