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金黄色葡萄球菌糖肽水解酶LytM表达调控及其生物学功能的初步研究

作　者: 牟春花
导　师: 杨光
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 金黄色葡萄球菌 LytM 溶菌活性 TRAP RNAⅢ
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种广泛存在的革兰氏阳性致病菌,是导致医院内感染和后天免疫性群体感染的最主要的原因之一。它可以引发多种疾病,如皮肤、黏膜的化脓性炎症,甚至危及生命的败血症、心内膜炎、肺炎和脑膜炎等;此外,金黄色葡萄球菌还可以引起异物相关感染、尿路感染、骨髓炎、关节炎和肠炎等感染性疾病。目前临床上抗金黄色葡萄球菌感染主要通过联合应用抗生素的方法,但耐药性金黄色葡萄球菌菌株MRSA（methicillin resistant Staphylococcus aureus）和VRSA（vancomycin resistant Staphylococcus aureus）的出现加重了金黄色葡萄球菌对人类健康的威胁。金黄色葡萄球菌致病过程中有多种分子的参与,深入研究这些分子的功能,将为金黄色葡萄球菌的防治提供理论基础。细菌能够产生多种自溶素,目前普遍认为自溶素参与细菌的繁殖、分离、隔膜的生成、鞭毛的生成等生理活动,但是其生理学和生态学的具体功能并不十分明确。根据作用于细胞壁肽聚糖化学键的位点差异,细菌自溶素主要分为以下几类:①糖苷酶和糖基转移酶,水解N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的糖苷键;②酰胺酶,水解N-乙酰胞壁酸和肽桥之间的酰胺键;③肽链内切酶,水解氨基酸侧链的肽键或肽桥上氨基酸之间的肽键。LytM蛋白是金黄色葡萄球菌产生的一种自溶素,属于肽链内切酶,在细菌生长过程中被分泌到细胞外,专一性水解葡萄球菌细胞壁肽聚糖甘氨酸与甘氨酸之间的肽键,导致细菌溶解,因此具有潜在的抗葡萄球菌感染的药用价值。LytM蛋白与模仿葡萄球菌（S. simulan）来源的溶葡萄球菌素（Lysostaphin）具有较高的同源性,是目前唯一一个解析晶体结构的Lysostaphin型Zn²⁺金属蛋白酶。体外研究结果表明,全长形式的LytM蛋白没有水解活性,只有其截短型C末端具有水解活性,但天然状态下,是否存在具有水解活性的LytM并不清楚;同时,LytM自身表达调控的相关机制及其相互作用蛋白也不明确。本研究以LytM蛋白为研究对象,旨在寻找金黄色葡萄球菌中LytM蛋白直接发挥水解作用的天然活性体形式,并进一步探讨调控LytM表达的分子机制以及寻找和鉴定LytM相互作用蛋白。本论文的主要内容如下:1. LytM天然形式活性体的寻找。我们利用原核表达系统体外重组表达了LytM及其C端185-316aa,并对其水解活性进行了检测,结果显示:全长形式的LytM蛋白没有水解活性,不能裂解金黄色葡萄球菌的细胞壁,而其C端(LytM_185-316)有水解活性。分别制备了高效价的LytM特异性鼠源和兔源多克隆抗体,并证实两种多克隆抗体均可以与全长形式的LytM及LytM185-316特异性结合。在此基础上,进一步通过Western Blot及免疫共沉淀的方法寻找和鉴定LytM的截短型天然活性体,尽管进行了多种条件的摸索和尝试,但最终没有成功钓取到金黄色葡萄球菌中LytM的天然活性体。分析原因,一方面可能是需要结合条件的进一步优化,另一方面的原因可能是天然状态下LytM活性体痕量存在,利用现有的方法难以获取达到检测水平的目的蛋白。2. LytM与TRAP蛋白相互作用的研究。我们已有的研究结果表明金黄色葡萄球菌中的信号分子TRAP蛋白能够特异性结合Lysostaphin。本研究中,我们通过ELISA和免疫共沉淀的方法证实了LytM可以与TRAP蛋白相互作用。同时我们通过基因重组的方法在金黄色葡萄球菌8325-4菌株中构建了lytM缺失突变体,进一步比较了野生型、lytM突变体及traP突变体的表型,探索了LytM与TRAP蛋白相互作用的可能的生物学意义。3. RNAⅢ调控LytM表达的分子机制研究。RNAⅢ是金黄色葡萄球菌中一种重要的具有调控作用的sRNA,其通过序列互补的方式调控靶基因的表达。在本研究中,RT-PCR及Western Blot的结果表明金黄色葡萄球菌RNAⅢ负调控LytM的表达。我们进一步将lytM的5’UTR与lacZ报告基因融合构建了报告载体,发现RNAⅢ可以通过作用于lytM的5’UTR负调控LytM的表达。同时我们将lytM 5’UTR与RNAⅢ相互作用区段中的特异位点突变,进一步证实了RNAⅢ与lytM的5’UTR的相互作用。综上所述,本研究重组表达了金黄色葡萄球菌LytM蛋白,并通过多种方法尝试寻找其天然形式的截短型活性体;同时我们发现了金黄色葡萄球菌TRAP蛋白是LytM的结合蛋白,两种基因突变菌株具有相似的表型改变;另外,我们的研究结果证实RNAⅢ作用于lytM的5’UTR负调控LytM的表达。以上研究结果将会为LytM功能的深入研究和新的抗金黄色葡萄球菌药物靶标寻找奠定基础。

全文目录

缩略语  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-13
  一、金黄色葡萄球菌的严重危害性及其防治策略  9
  二、金黄色葡萄球菌糖肽水解酶LytM的研究  9-11
  三、金黄色葡萄球菌TRAP蛋白  11
  四、金黄色葡萄球菌中RNAIII的研究  11-12
  五、研究思路  12-13
第一部分 LytM 天然形式活性体的寻找  13-26
  1.1 实验材料  13-15
  1.2 实验方法  15-19
  1.3 结果  19-24
  1.4 讨论  24-26
第二部分 LytM 与TRAP 蛋白相互作用的研究及其生物学功能的初步探讨  26-44
  1.1 实验材料  26-27
  1.2 实验方法  27-32
  1.3 结果  32-42
  1.4 讨论  42-44
第三部分 RNAⅢ 调控lytM 表达的分子机制研究  44-55
  1.1 实验材料  44-45
  1.2 实验方法  45-48
  1.3 结果  48-54
  1.4 讨论  54-55
结论  55-56
参考文献  56-60
致谢  60-61
个人简历  61-62
综述  62-68
  参考文献  66-68
附录  68-71

金黄色葡萄球菌糖肽水解酶LytM表达调控及其生物学功能的初步研究

内容摘要

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