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重组金黄色葡萄球菌蛋白A的制备性质研究与应用

作　者: 唐秀
导　师: 李素霞
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 金黄色葡萄球菌蛋白A 耐碱性耐酸性固定化抗体纯化
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

金黄色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A, SPA)是存在于大多数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种蛋白。蛋白A是单一多肽链,分子中无色氨酸(Trp),有高度类似的Fc结合位点。本文以金黄色葡萄球菌的基因组为模板,成功构建了蛋白A的重组表达菌株,并筛选出了表达量较高的克隆SPA30。此外,还成功构建出SPA30的截短体SPA25以及大分子蛋白SPA45。本文通过实验研究了不同分子量大小的蛋白A的性质,如耐酸性、耐碱性和耐高温性,并根据其性质差异确定了不同蛋白的纯化条件,最终得到了纯度高达97%的目的蛋白。SPA25对0.25 M的HCl耐受性较好；经0.5 M HCl处理30min时蛋白仅稍有降解。重组SPA30菌株用0.2 M HCl处理0.5～1 h时,杂质较少,目的蛋白较纯；在0.5 M HCl中处理1h无明显变化。SPA45在0.5 M HCl中处理1 h,蛋白无降解,耐酸性较好。SPA25重组菌经0.5 M NaOH处理40 min后无明显变化。用不高于0.2 M的NaOH裂解重组菌SPA301 h,得到的目的蛋白SPA30较纯。SPA45对0.25 MNaOH的耐受性较好。SPA25在4-70℃的温度下放置6h,蛋白稳定性较好。SPA45在常温下稳定性不如SPA25。SPA30在4℃时放置过夜后蛋白稍有降解,常温下极易降解。在蛋白A的应用研究方面,以环氧氯丙烷(ECH)为活化剂,通过正交试验确定了琼脂糖凝胶的最佳活化条件：ECH浓度20%(v/v),NaOH浓度0.8 M,加入体积1 ml,活化时间2.5 h,反应温度40℃。进行基团偶联实验时发现在pH6.4～8.0的条件下-SH均可偶联到活化胶上；在pH 10～11时,-NH2可偶联。蛋白A作配基偶联活化后的Sepharose 4FF可用于纯化兔免疫蛋白IgG。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章前言  12-22
  1.1 金黄色葡萄球菌蛋白A简介  12-13
    1.1.1 金黄色葡萄球菌蛋白A的发现  12
    1.1.2 蛋白A的理化性质  12-13
  1.2 蛋白A的免疫学性质  13-15
  1.3 蛋白A的研究进展与应用  15-20
    1.3.1 蛋白A的结构与性质研究  15-16
    1.3.2 蛋白A的应用研究  16-20
  1.4 课题研究目的及意义  20-22
第二章实验材料与方法  22-28
  2.1 实验材料与设备  22-23
    2.1.1 实验材料  22-23
    2.1.2 实验设备  23
  2.2 实验方法  23-28
    2.2.1 蛋白含量测定-紫外吸收法  23-24
    2.2.2 蛋白含量测定-Bradford法  24-25
    2.2.3 蛋白含量测定-凯氏定氮法  25
    2.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)  25-26
    2.2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)  26-27
    2.2.6 正交试验设计  27-28
第三章金黄色葡萄球菌蛋白A的克隆与表达  28-35
  3.1 引言  28
  3.2 实验材料与方法  28
  3.3 结果与讨论  28-34
    3.3.1 金黄色葡萄球菌SPA30基因的克隆  28-32
      3.3.1.1 金黄色葡萄球菌总DNA的提取及PCR扩增  29
      3.3.1.2 PCR产物的连接、转化及转化子的筛选和鉴定  29
      3.3.1.3 目的基因的测序与比对结果  29-30
      3.3.1.4 金黄色葡萄球菌SPA30基因的表达  30
      3.3.1.5 克隆载体的酶切以及表达载体的制备  30-31
      3.3.1.6 SPA30的转化以及表达鉴定  31
      3.3.1.7 温度对SPA30表达的影响  31-32
      3.3.1.8 不同IPTG浓度对诱导SPA30表达的影响  32
    3.3.2 金黄色葡萄球菌SPA25的表达  32-33
    3.3.3 金黄色葡萄球菌SPA45的表达  33-34
  3.4 本章小结  34-35
第四章金黄色葡萄球菌蛋白A的纯化与性质  35-45
  4.1 引言  35
  4.2 实验方法  35
    4.2.1 蛋白A对酸耐受性  35
    4.2.2 蛋白A对碱耐受性  35
    4.2.3 蛋白A温度稳定性  35
    4.2.4 蛋白A浓度的确定  35
  4.3 实验结果与讨论  35-44
    4.3.1 蛋白A对酸耐受性  35-38
      4.3.1.1 SPA25对酸耐受性  35-36
      4.3.1.2 SPA30对酸耐受性  36-38
      4.3.1.3 SPA45对酸耐受性  38
    4.3.2 蛋白A对碱耐受性  38-41
      4.3.2.1 SPA25对碱耐受性  38-39
      4.3.2.2 SPA30对碱耐受性  39-41
      4.3.2.3 SPA45对碱耐受性  41
    4.3.3 蛋白A温度稳定性  41-43
      4.3.3.1 SPA25温度稳定性  42-43
      4.3.3.2 SPA30温度稳定性  43
    4.3.4 不同方法测定SPA25浓度  43-44
      4.3.4.1 紫外吸收法测定蛋白浓度  43
      4.3.4.2 灰度扫描法测定蛋白浓度  43-44
      4.3.4.3 凯氏定氮法测定蛋白浓度  44
  4.4 本章小结  44-45
第五章金黄色葡萄球菌蛋白A的纯化与生物亲和性研究  45-58
  5.1 引言  45
  5.2 实验材料与方法  45-47
    5.2.1 实验材料  45-46
      5.2.1.1 蛋白纯化材料  45
      5.2.1.2 ELISA检测试剂  45
      5.2.1.3 Dottern检测试剂  45-46
    5.2.2 实验方法  46-47
      5.2.2.1 蛋白样品预处理  46
      5.2.2.2 DEAE-FF离子交换层析  46
      5.2.2.3 镍柱(Ni-NTA)亲和纯化  46
      5.2.2.4 ELISA检测操作  46-47
      5.2.2.5 Dottern检测操作  47
  5.3 结果与讨论  47-56
    5.3.1 离子交换柱DEAE Sepharose FF纯化SPA30  47-54
      5.3.1.1 SPA30的纯化  47-48
      5.3.1.2 SPA25的纯化  48-52
      5.3.1.3 SPA45的纯化  52-54
    5.3.2 Ni柱亲和层析纯化SPA30  54-55
    5.3.3 SPA与IgG抗体亲和性研究  55-56
      5.3.3.1 ELISA试验检测SPA30与不同IgG抗体的亲和力  55
      5.3.3.2 Dottern实验检测SPA30与不同IgG抗体的亲和力  55-56
      5.3.3.3 Dottern实验检测SPA45和SPA25与不同IgG抗体的亲和力  56
  5.4 本章小结  56-58
第六章蛋白A的固定化与抗体的纯化  58-65
  6.1 引言  58
  6.2 实验方法  58-60
    6.2.1 环氧氯丙烷法活化琼脂糖凝胶  58
    6.2.2 标准盐酸溶液的标定  58-59
    6.2.3 环氧基修饰密度的定量分析  59
    6.2.4 配基与活化胶的偶联  59
    6.2.5 抗体的纯化  59-60
  6.3 实验结果与讨论  60-64
    6.3.1 正交试验优化琼脂糖凝胶活化因素  60-61
    6.3.2 活化胶偶联基团条件  61-62
    6.3.3 抗体的纯化  62-64
      6.3.3.1 平衡缓冲液中NaCl浓度对抗体纯化的影响  62-63
      6.3.3.2 洗脱流速对抗体纯化的影响  63
      6.3.3.3 不同条件下偶联胶对抗体纯化的影响  63-64
  6.4 本章小结  64-65
第七章结论与展望  65-67
参考文献  67-76
致谢  76

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