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志贺氏菌HtrA蛋白的功能研究

作　者: 马姗姗
导　师: 王恒樑; 朱力
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 遗传学
关键词: 福氏2a志贺氏菌 HtrA蛋白基因敲除双向电泳蛋白相互作用
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

志贺氏菌(Shigella spp.)俗称痢疾杆菌,作为一种具有高度传染性革兰氏阴性肠道致病菌,主要通过侵入人结肠上皮细胞最终定位于大肠,而引起典型细菌性痢疾(发热、腹痛、里急后重、大便脓血)。志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌),2010年我国卫生部公布的全年法定报告传染病疫情中,细菌性痢疾发病数位居第四,其中福氏2a型占到细菌性痢疾总数的50-70%,次于病毒性肝炎,肺结核和梅毒。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素,但不同菌群及血清型之间虽然无交叉免疫,但存在交叉抗药性,加上临床分离多重耐药菌株的不断增加,常规的抗生素治疗遇到了巨大的挑战;虽然最有效的预防措施是疫苗接种,由于对其致病机理和宿主的免疫保护机制还不很清楚,故迄今为止仍未有理想的痢疾疫苗。因此,开展志贺氏菌的研究具有重要意义。本实验室在研究温度对志贺氏菌蛋白表达谱影响的基础上,发现HtrA蛋白在双向电泳图中呈现为两个分子量相同等电点不同的两个结构异构体蛋白点,并且随着ArgT蛋白表达量的变化,HtrA蛋白点的丰度呈现反向变化,这一现象可能说明HtrA存在翻译后修饰过程并且与其功能密切相关。HtrA蛋白,又称DegP,基因组注释为周质丝氨酸蛋白酶Do,热休克蛋白HtrA。由于HtrA的特殊功能,在高于35℃时随着温度的升高其蛋白酶活性也增加(本研究采用37℃),而在低于此温度条件下(本研究采用30℃)发挥分子伴侣功能这一特殊情况,我们力图发现其天然底物蛋白及可能具有的新功能。特别要提出的是,在30℃条件下志贺氏菌不能侵袭上皮细胞,而在37℃时能发挥完整的侵袭能力,这表明在这两种不同温度下存在差异的蛋白,可能会影响到志贺氏菌的毒力。此外,在其他病原菌中也有HtrA蛋白作为毒力因子的研究报道。由于在大肠杆菌中的研究证明,HtrA蛋白同时具有蛋白裂解酶和分子伴侣的双重功能,本文将对HtrA蛋白在福氏2a志贺氏菌2457T及301中的功能进行深入细致的研究。本文利用改进过的λ-Red重组系统成功的敲除了志贺氏菌福氏2a 2457T及301基因组htrA基因,构建了该基因的缺失突变株,同时利用低拷贝质粒成功的构建了回复株及带标签的回复突变株,并对缺失株及突变株进行了初步的研究。通过豚鼠角膜实验检测缺失了htrA基因对志贺氏菌福氏2a 2457T及301毒力的影响,结果表明缺失了htrA基因不能引起豚鼠角膜的炎症反应,而野生株及回复突变株均能引起豚鼠角膜强烈的炎症反应。使用双向电泳与质谱相结合的方法对突变株与野生株在30℃和37℃条件下的蛋白表达谱进行分析。两种菌株之间对比得出的差异蛋白很有可能是HtrA蛋白的天然底物。此外,我们还要特别关注两种不同温度条件下差异的蛋白,这些蛋白对志贺氏菌的毒力也可能会有影响。通过比较蛋白质组学,并对差异点进行了胶内酶切和质谱鉴定。结果表明:各自存在多个蛋白差异,我们对这些蛋白进行了功能分析。其次,由于蛋白在细胞中并不能独立完成各项生物学功能,必须与其他蛋白发生相互作用而形成复合物,并在此基础上形成复杂的功能网络,才能在特定的时间和空间发挥特定的功能。因此本文利用GST pull down和免疫共沉淀的方法捕获同HtrA相互作用的蛋白。为了排除标签对HtrA蛋白功能的影响,分别使用两种不同的标签标记HtrA的N端及C端,以便最大限度发现能与HtrA相互作用的蛋白。于是将Flag标签序列添加到完整的HtrA蛋白编码序列的C端,HtrA蛋白定位于周间质;同时由于HtrA蛋白序列含信号肽,故将GST蛋白与志贺氏菌HtrA蛋白N端信号肽去除后的序列融合表达,HtrA蛋白定位于细胞胞质。同时,为了防止HtrA蛋白发生自降解,将HtrA蛋白的第210位Ser突变成了Ala,在不改变其结构的基础上,使其失去蛋白酶活性。因此分别抓捕了30℃和37℃下能够与HtrA相互作用的蛋白,并通过对这些相互作用蛋白进行双向电泳分离,通过对比得到可能的特异性结合蛋白。这种方法获得的差异蛋白结果比较可靠,并进行质谱鉴定。本研究用这种方法初步筛选到了3个可能具有特异性结合的蛋白,对于这初筛的结果提示的仅仅是一种可能性,是否真实存在相互作用还需进一步验证。综上所述,本研究成功的构建了福氏2a志贺氏菌2457T及301的htrA基因缺失株,并进行验证;根据豚鼠角膜炎症反应揭示了HtrA蛋白同志贺氏菌致病性及侵袭力之间的关系;通过比较蛋白质组学及质谱技术的结合从全局水平综合分析了可能的HtrA天然酶底物;利用GST pull down及免疫共沉淀的原理捕获了与HtrA相互作用的蛋白并通过双向电泳进行分离质谱鉴定。由于30℃和37℃条件下志贺氏菌的毒力存在差异,因此这两种不同温度下存在的差异蛋白也可能会对志贺氏菌的毒力产生影响,是潜在的毒力相关蛋白。以上实验可以进一步阐明志贺氏菌HtrA蛋白可能具有的生物学功能。

全文目录

缩略语索引  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-20
第一部分志贺氏菌htrA 突变株的构建及验证  20-39
  1 材料与方法  21-23
  2 方法  23-29
  3 结果与分析  29-35
  4 讨论  35-37
  参考文献  37-39
第二部分志贺氏菌野生株、htrA 基因缺失突变株、回复突变株蛋白表达谱的比较  39-59
  1 材料与仪器试剂  40-41
  2 方法  41-45
  3 实验结果  45-52
  4 讨论  52-57
  参考文献  57-59
第三章分离及鉴定与HtrA 相互作用的蛋白  59-70
  1 材料与仪器试剂  60-61
  2 方法  61-63
  3 实验结果  63-67
  4 讨论  67-69
  参考文献  69-70
总结  70-71
综述  71-76
  参考文献  75-76
研究论文  76-83
个人简历  83-84
致谢  84

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