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FMR1基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响

作　者: 祝亚桥
导　师: 周兴
学　校: 广州医学院
专　业: 外科学
关键词: 脆性X智力低下1号基因基因敲除生殖精子发生
分类号: R698.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

最近半个世纪，随着社会的发展，不育夫妇的发病率逐年升高。2004年欧洲统计结果显示：育龄夫妇一年内不能怀孕者占20%，其中为男方因素引起的不育占50%[1]。据WHO的意见，目前已知的男性不育因素包括精索静脉曲张（12.3%），性功能障碍（1.7%），生殖道感染（6%），先天性发育异常（2.1%），后天获得性疾病（2.6%），内分泌紊乱（0.6%），免疫性因素（3.1%）及其他疾病（3%），其他大约70%以上的男性不育发病机理不明[2]，使得男性不育的诊治变得复杂和特殊。近年来，对男性不育的遗传性病因不断有一些新的发现，对可导致男性不育的遗传缺陷，如X染色体上的遗传、Y染色体无精症因子区的微缺失、及染色体异常和其他某些已知基因的突变等，但上述因素只能解释约15%的病例。因此对男性不育的研究已显得非常重要。在原发性男性不育病人中，精子发生障碍为主要的类型[3]，因此与精子发生密切相关的那些基因也成为研究男性不育的候选基因。人类的精子发生是一个极非常复杂的过程，涉及到原始生殖细胞增殖，减数分裂，细胞分化等，据估计至少有4000多个基因参与精子发生过程中。近年来已鉴定出众多与精子发生密切相关的基因，但这些基因是否都与男性不育相关，尚需进一步的实验研究。脆性X综合征(fragile X syndrome，FXS)是最常见的遗传性智力低下性疾病之一，发病率仅次于Down综合征，占非特异性智力低下的2%-6%，在X连锁智力低下中占40%。FXS患者存在有不同程度的智力低下、注意力障碍、癫痫易发作、性格改变、活动过度、自闭等社会行为的异常，特殊面容及男性青春期后大睾丸（单侧大于25ml）、生育功能低下，女性成年后卵巢早衰[4-6]。其发病机制是由于X染色体上的脆性X智力低下基因（fragile X mental retardation gene1，FMR1）5’端（CGG）三核苷酸重复序列的异常扩增及其邻近部位的CpG岛异常甲基化，导致FMR1基因沉默不表达，即其蛋白产物脆性X智力低下蛋白（fragile X mentalretardation protein，FMRP）减少或缺乏而发病。目前研究发现FMRP主要在脑和睾丸中表达，且起到重要的作用。为了发现FXS患者发病的复杂机制，更好的治疗这一类疾病，FXS患者的生殖系统及智力行为等相关问题正成为研究热点。FXS的疾病研究中，FMR1基因敲除鼠模型是目前公认的研究FXS最好的小鼠模型，其多方面的异常表现与FXS病人颇为相似，如过度活动，学习障碍，青春期后睾丸增大等[7,8]，因此我们通过对FMR1基因敲除鼠雄性生殖系统及其功能的研究，来进一步了解FMR1基因对雄性生殖及性行为的影响。研究目的我们的研究目的在于利用FMR1基因敲除鼠，研究FMR1基因敲除对雄性小鼠性功能、生殖功能的影响，为进一步研究FMR1基因对个体的生殖系统的影响、在精子生成中的调节机制和提供可能的治疗措施打下坚实的基础。材料与方法1．实验动物：FMR1基因敲除型（KO）纯合子（-/-）及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠，采用PCR法检测实验小鼠的FMR1基因片段，经基因鉴定后，由广州医学院实验动物中心饲养及繁育。2．动物分组：2.1生殖实验及观察方法：共72只。将雄性FMR1基因敲除鼠（KO）12只和雄性野生型FVB小鼠（WT）12只，每只分别与两只野生型FVB成年母鼠（共48只）合笼5天，观察雄性行为，记录自雌鼠放入至雄鼠发生第一次捕捉雌鼠的时间（捕捉潜伏期）、30min内雄鼠捕捉雌鼠的次数；母鼠怀孕率，母鼠平均产仔数及雄鼠的生育指数；收集双侧睾丸、附睾组织，称重并计算脏器系数；对一侧附睾尾部精子进行计数、活率、形态等分析；测定雄鼠血清T,FSH及LH浓度。2.2组织学实验及观察方法：共10只。其中KO组和WT组成年雄鼠各五只，灌注固定收集右侧睾丸、附睾常规石蜡包埋、切片、HE染色，高倍显微镜下分析。3统计方法：所有数据采用均数±标准差(X±SD)表示，WT与KO鼠两组数据间的比较用两独立样本t检验，采用SPSS15.0软件进行统计学分析，P值﹤0.05为有统计学意义。结果1.睾丸、附睾脏器系数比较结果：KO组雄鼠睾丸、附睾重量均显著高于WT组，KO鼠和WT鼠体重比较结果无明显差异，KO鼠睾丸、附睾脏器系数高于WT鼠。2.生殖实验结果：KO鼠捕捉潜伏期15.76±6.14min较WT鼠9.24±5.32min明显延长(P<0.05)，30min内捕捉次数也减少。KO鼠雄性生殖率41.7%低于WT鼠91.7%(P<0.05)，与KO组小鼠交配的母鼠怀孕率41.7%低于WT组87.5%（P<0.05），KO组和WT组母鼠平均产仔数分别为6.50±2.27和8.22±3.03（P>0.05），无显著差异。3.精子分析结果：两组小鼠在精子计数、精子活率、精子各种畸形率比较均没有统计学差异。4.性激素测定结果：比较两组小鼠血清游离T、FSH、LH无统计学差异。5.睾丸、附睾组织学观察结果：KO组睾丸组织中曲细精管直径，生精小管上皮的结构及厚度未见明显差异，支持细胞，精原细胞，各级生精细胞形态及数量与WT组未见明显异常，附睾形态、上皮厚度等未见明显异常。结论可以推测FMR1基因对雄性性行为、生殖系统发育有一定的影响，睾丸、附睾的重量会增加，FMR1基因的缺失降低了雄性小鼠生育率，但对睾丸、附睾脏器的组织学及精子生成、精子畸形率等未见明显影响，其对雄性生殖系统影响机制还有待进一步的实验研究。

全文目录

中英文对照  4-5
中文摘要  5-8
Abstract  8-12
前言  12-14
材料与方法  14-24
结果  24-31
讨论  31-37
结论  37
展望  37-38
参考文献  38-43
综述  43-53
  参考文献  49-53
致谢  53-54

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