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刺参多糖对神经干细胞迁移的作用及其机制研究

作　者: 李敏
导　师: 吉爱国
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 刺参多糖神经干细胞迁移 N-钙粘素 PI3K/Akt
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)因具有有自我更新和多向分化潜能,成为治疗神经退行性疾病及脑损伤等中枢神经系统疾病的新途径。NSCs作为未来神经组织修复的种子细胞,移植后细胞的存活和功能的建立仍然存在许多问题。如何调节干细胞的生长和迁移也是目前神经科学研究的热点。目前,许多学者正在寻找能够诱导干细胞迁移和增殖的药物,提高细胞移植的治疗效果,以达到修复损伤神经组织的目的。近年来,刺参多糖及其复合物己被报道在抗肿瘤,抗凝血等方面的药理活性,而对神经系统疾病的作用研究还较少见。本课题以从鲜刺参中提取分离得到的刺参多糖(SJP)为原料,研究SJP对NSCs体外迁移的影响,并探讨SJP促进NSCs体外迁移的作用机制。研究内容及结果如下：1.刺参多糖分离纯化及性质测定从新鲜海参体壁中提取得到刺参多糖粗提物,将粗提物经过DEAE-Sepharose离子交换层析后得到SJP1、SJP2、SJP3、SJP4四个多糖组分。通过体外神经球迁移实验对多糖组分进行活性筛选,收集活性组分SJP3。对SJP3进行Sephacryl S-200HR凝胶柱层析得到SJP3-1和SJP3-2两个多糖组分,活性检测表明SJP3-1具有促进神经球迁移作用,因此我们将SJP3-1(以下简写SJP)用于随后实验。苯酚硫酸法测得SJP中总糖含量为57.18%,硫酸咔唑法测得糖醛酸含量为12.39%,BaCl2-明胶比浊法测得硫酸盐含量29.75%。考马斯亮蓝法和UV光谱分析表明,SJP不含游离蛋白质和核酸成分。IR光谱图显示SJP具有硫酸化多糖典型的红外吸收特征。高效凝胶过滤色谱分析结果表明,SJP为均一组分,以葡聚糖为标准品测得SJP相对分子量为1.79×105Da。旋光仪测得SJP的0.1%水溶液的比旋度[α]20D-48.62。2.剌参多糖对体外NSCs作用研究首先,建立神纤前体细胞体外培养形成悬浮的神经球体系。我们从E14.5天Wistar大鼠的胚胎脑组织中分离获得细胞，用添加生长因子EGF和bFGF的DMEM/F12+B27培养基进行培养。免疫荧光染色检测培养细胞中Nestin表达.2%血清诱导细胞分化，对分化后细胞进行GFAP和Fujl免疫荧光染色检测。结果表明细胞Nestin免疫荧光染色鉴定阳性,且诱导分化后能定向分化为神经元和星型胶质细胞。因此,我们分离培养的细胞为神经干细胞。然后我们研究不同浓度SJP对体外NSCs迁移、存活、增殖及分化的作用。体外神经球迁移实验结果显示,SJP能够剂量依赖性促进体外培养的神经干细胞球粘附于培养表面并迁移。利用Brdu标记实验,对SJP对NSCs增殖作用影响进行检测,Hoechst/PI双染检测SJP对NSCs凋亡的影响,结果显示SJP能够维持NSCs在撤除生长因子的培养条件下的存活能力。免疫荧光染色对SJP作用后细胞类型变化进行鉴定,显示SJP能够促进迁移的细胞向神经元和星型胶质细胞分化。RT-PCR结果显示,SJP能下调Nestin mRNA水平,上调GFAP及Tuj1的mRNA水平3.SJP促进NSCs体外迁移的机制研究利用RT-PCR及、Nestern blot检测SJP作用后N-cadherin在mRNA及蛋白水平的表达变化,结果显示,SJP能够剂量依赖性地上调N-cadherin表达。通过阻断信号通路,分别研究了SJP作用过程中ERK. BMP和PI3K/Akt信号通路参与情况。结果显示,PI3K抑制剂LY294002抑制SJP激活的Akt磷酸化,并显著抑制SJP的促进神经球迁移作用。同时,LY294002预处理显著抑制SJP引起的N-cadherin蛋白表达升高,而ERK抑制剂(PD98059)和BMP抑制剂(Noggin)对这些现象没有影响。综上,我们认为SJP促进NSCs迁移的作用机制为：SJP通过上调Akt磷酸化,激活PI3K/Akt信号通路,使粘附分子N-cadherin农达增高,促使神经球粘附于培养表面并发生细胞迁移。本论文研究表明刺参硫酸化多糖SJP能够促进胚胎NSCs的迁移能力并促进NSCs向神经元、星型胶质细胞分化,因而,SJP有可能通过维持神经干细胞存活,诱导移植十细胞向病灶部位迁移并分化成正常神经细胞而提高移植的治疗效果。因此,SJP有可能在神经干细胞移植治疗神经系统疾病的辅助治疗中发挥重要作用。

全文目录

中文摘要  11-13
Abstract  13-16
符号说明  16-18
第一章前言  18-28
  1. 神经干细胞及其应用  18-19
    1.1 神经干细胞概述  18
    1.2 神经干细胞移植  18-19
  2. 神经干细胞迁移  19-22
    2.1 NSCs的迁移  19-20
    2.2 NSCs迁移研究意义  20-21
    2.3 NSCs迁移研究进展  21-22
  3. 海参及其药理活性研究进展  22-27
    3.1 海参概述  22-23
    3.2 海参的营养成分研究  23-24
    3.3 海参药理活性研究  24-27
  4. 课题的研究目的及意义  27-28
第二章刺参多糖的分离纯化  28-36
  1.实验材料  28-29
    1.1 原料  28
    1.2 仪器与耗材  28-29
    1.3 实验试剂  29
  2. 实验方法  29-31
    2.1 刺参岩藻多糖的提取分离  29
    2.2 刺参岩藻多糖的性质测定  29-30
    2.3 活性筛选实验  30-31
  3. 实验结果  31-33
    3.1 刺参多糖的提取分离及纯化  31
    3.2 SJP的理化性质测定  31-32
    3.3 SJP的红外光谱分析  32
    3.4 SJP纯度及相对分子量测定  32-33
    3.5 SJP旋光度测定  33
  4. 讨论  33-34
  5. 本章小结  34-36
第三章 SJP对神经干细胞迁移的作用  36-58
  1. 实验材料  36-39
    1.1 实验动物  36
    1.2 仪器与设备  36
    1.3 实验耗材  36-37
    1.4 实验试剂  37-39
  2. 实验方法  39-46
    2.1 NSCs的分离、培养及鉴定  39-42
    2.2 SJP对NSCs细胞增殖、迁移及分化的影响  42-45
    2.3 数据分析和统计  45-46
  3. 实验结果  46-53
    3.1 NSCs细胞形态观察  46-47
    3.2 NSCs的鉴定  47-48
    3.3 SJP对神经干细胞的生物学作用  48-53
  4. 讨论  53-56
    4.1 神经干细胞培养及鉴定  53-54
    4.2 刺参多糖对体外神经干细胞的作用  54-56
  5. 本章小结  56-58
第四章 SJP促进神经干细胞迁移的作用机制研究  58-74
  1. 实验材料  58-63
    1.1 仪器与设备  58-59
    1.2 实验耗材  59
    1.3 实验试剂  59-63
  2. 实验方法  63-67
    2.1 NSCs的培养  63
    2.2 SJP对神经干细胞N-cadherin在mRNA水平的影响  63-65
    2.3 SJP对神经干细胞N-cadherin在蛋白水平的影响  65-67
    2.4 信号通路阻断剂对SJP促迁移作用的影响  67
  3. 实验结果  67-72
    3.1 SJP对神经干细胞N-cadherin在mRNA水平的影响  67-68
    3.2 SJP对神经干细胞N-cadherin在蛋白水平的影响  68-69
    3.3 阻断不同信号通路对SJP促进神经球粘附和迁移的影响  69-70
    3.4 阻断PI3K信号通路对N-cadherin蛋白水平的影响  70-72
  4. 讨论  72-73
  5. 本章小结  73-74
论文总结  74-76
参考文献  76-86
致谢  86-88
攻读学位期间发表的论文  88-89
学位论文评阅及答辩情况表  89

刺参多糖对神经干细胞迁移的作用及其机制研究

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