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刺参多糖对神经细胞作用的研究

作　者: 盛卸晃
导　师: 吉爱国
学　校: 山东大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 刺参多糖 神经干细胞 星形胶质细胞 细胞迁移 细胞活化 Rho-ROCK通路 PI3k/Akt通路
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


研究背景：神经系统疾病是全球首位致残疾病和第3位主要致死因素。如脑中风会引起大脑损伤区域神经元和神经元连接广泛缺失,导致长期的神经功能障碍。目前药物干预主要局限在急性期的脑损伤保护,如重组组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)仅适合于急性期恢复脑供血等。尚不能对中风引起的长期神经功能障碍起到有效的治疗和恢复作用。因此,寻找能有效恢复损伤后亚急性其和慢性期神经功能的治疗方法,药物或保健食品意义都非常重大在我国,海参一向被视为药食两用的海产佳品,其中尤以剌参为佳。刺参广泛应用于年老体弱者,记忆力减退着,中风患者术后以及神经退行性疾病患者的保健和恢复。可见刺参对预防神经衰退,增强和恢复神经组织功能发挥积极作用,且食用刺参没有副作用。所以,深入研究刺参活性成分的药理作用对发挥刺参在维护人民身体健康方面具有重要的意义,同时也为刺参产业的发展起积极的作用。本研究从刺参体壁中分离获得具有药理活性的刺参多糖,探讨其对神经细胞的作用方式及其作用机制。实验方法：1.刺参多糖的分离纯化、活性筛选和理化性质鉴定实验采用为蛋白酶/胰蛋白酶双酶解法,乙醇沉淀获得粗多糖,大孔吸附树脂脱色,用DEAE-sepharose阴离子交换柱分离,获得A、B、C、D四个多糖组分,用Sephacryl S-200凝胶进一步春华并脱盐。将分离获得的组分分别用神经干细胞球迁移实验(HS-3活性最好)和星形胶质细胞活化进行活性筛选(HS-4活性最好)。选取有活性的单一糖组分进行理化性质鉴定，采用HPLC法做纯度检查，自动旋光仪检测比旋光度，苯酚硫酸法检测总糖含量，硫酸咔唑法检测糖醛酸含量,明胶BaCl2法检测硫酸根含量, Bradford法检测蛋白质含量,凝胶色谱法检测多糖分子量。2、HS-3促进神经干细胞球迁移作用研究。本实验从孕14.5天胎鼠大脑皮层分离神经干细胞,培养在含EGF、FGF-2的培养基中。相差显微镜测量HS-3在基础培养基中(无EGF/FGF-2)促进神经干细胞球迁移的距离,用Hoechst/PI双染法检测细胞存活情况,用BrdU labeling法检测细胞的增殖状态,免疫荧光法观察神经干细胞在含HS-3的培养基中的分化状态,用信号通路抑制剂(P13K抑制剂LY294002, ERK抑制剂PD98059,BMP抑制剂noggin)、Western blotting和RT-PCR技术检测HS-3诱导细胞粘附和迁移可能的作用机制。3、HS-4与FGF-2协同诱导星形胶质细胞活化作用研究星形胶质细胞活化主要包括三个方面：1)细胞形态变化；2)细胞由静息期进入细胞分裂期,细胞增殖；3)细胞发生迁移。本实验从新生大鼠大脑中经胰酶消化分离,机械振荡法纯化获得星形胶质细胞。首先通过MTT法检测HS-4对细胞的毒性作用以确定后续试验的使用浓度和作用时间。用伊红染色和免疫荧光染色法观察HS/FGF-2诱导细胞的形态变化,western blotting检测星形胶质细胞特征蛋白GFAP的表达情况。BrdU插入法检测细胞增叭,流式细胞术检测细胞周期变化情况,Western blotting检测细胞周期调控蛋白ICyc D1农达水平Transwell法检测HS-4/FGF-2促进细胞迁移作用。用细胞通路各抑制剂(Rho通路抑制剂Y27632, PI3K抑制剂LY294002, ERK抑制剂PD98059,P38抑制剂SB203580, JNK抑制剂SP600125)、免疫荧光和Western blotting技术检测HS-4/FGF-2诱导细胞形态变化可能的作用机制。实验结果：l、刺参多糖的分离纯化与理化性质鉴定本实验通过离子交换色谱分离获得四个多糖组分,经细胞活性检测确定HS-3具有促进神经干细胞球迁移和分化作用：HS-4对诱导星形胶质细胞活化的作用效果最为显著经鉴定,HS-3的理化性质为：HPLC检测确定其为均一物质,分子量约为1.79×102Da,旋光度为[α]D20-48.62°(c0.1, H2O),总糖含量为57.18%,酸性多糖含量为12.39%,SO42-含量为29.75%。HS-4的理化性质为：分子量为4.23×105Da,总糖含量为38.12%,酸性多糖含量为16.52%,硫酸根含量为32.64%,单糖组分主要以岩藻糖为主,还含有小部分半乳糖,不含蛋白质和核酸。2、HS-3促进神经干细胞球迁移作用研究。从胎龄为E14.5d胚胎大脑皮层中提取的神经干细胞,在含有外源性生长因子bFGF和EGF存在的条件下细胞会分裂增殖,聚集成团,即神经细胞球。经鉴定提取的神经干细胞BrdU染色呈阳性,Nestin荧光染色呈阳性,经含.2%胎牛血清诱导后可以分化为星形胶质细胞(GFAP阳性)和神经元细胞(TUJ1阳性)。HS-3能诱导神经球在末铺P-L-L的培养板中粘附和迁移,迁移距离呈现浓度依赖性,在80μg/mL HS-3作用72h后,神经球的迁移距离为438μm。HS-3还能有效维持神经球在撤离生长因子后细胞的存活。在HS-3的刺激下，神经干细胞能分化为神经元和星形胶质细胞,浓度增加,分化为神经元的比例增大；且更有意义的是分化的神经元细胞能沿着神经球轴线向外迁移,而分化的星形胶质细胞滞留在神经球中,。PD98059和Noggin对HS-3介导的细胞迁移没有影响,而LY294002能有效抑制神经球的迁移(P<0.01)，且LY294002的预处理能有效抑制HS-3诱导的Akt (ser-473)蛋白磷酸化水平的升高及N-cadherin蛋白表达水平的升高。因此,HS-3诱导神经球迁移可能的作用机制是通过N-cadherin蛋白介导的,PI3K/Akt活化的信号通路。3、HS-4与FGF-2协同诱导星形胶质细胞活化作用研究从新生大鼠大脑中分离的星形胶质细胞经机械振荡法纯化后,GFAP染色鉴定阳性率在97%以上,体外培养的细胞在体外传代2次以后,细胞骨架发生变化,形态转变为多角形,边界模糊,细胞计入G0/G1期,处于细胞静息状态。HS-4联合FGF-2共同作用后胶质细胞形态发生转变,由静息状态的多角兴,边界模糊,无明显突触突起转变为有多个突触突起,细胞呈星形,边界清晰,细胞染色变亮。Western blotting检测GFAP蛋白表达水平显著提高。表明HS/FGF-2刺激后细胞骨架蛋白发生重组,形态改变。细胞BrdU阳性率显著上升,山对照组的13.047增加剂到55.29%,表明经HS-4诱导后大部分细胞进入细胞分裂期。流式细胞术检测细胞周期显示,经HS/FGF-2处理后,大量细胞由G0/G1进入S期,细胞周期素Cyc D1表达水平明显升高。静息态细胞不能穿过Transwell膜,即无迁移活性,经HS/FGF-2诱导活化后的星形胶质细胞具有迁移活性,能穿过Transwell膜。上述结果证实HS-4能诱导星形胶质细胞活化。PI3K抑制剂能轻微抑制HS-4/FGF-2诱导的胶质细胞活化作用,ERK抑制剂能完全抑制星形胶质细胞的活化,JNK抑制剂几乎没有任何抑制作用,而P38抑制剂反而在一定程度上能促进HS-4/FGF-2诱导的活化作用。培养液加入EGTA通过结合Ca2+可以抑制细胞的活化。Rho-Rock抑制剂能迅速促进星形胶质细胞活化。结论：本实验从刺参体壁中获得了两种富含硫酸基的酸性多糖且对神经细胞具有不同的活性作用。其中HS-3促进神经十细胞球的粘附和迁移,维持神经球的存活,诱导细胞分化为神经元和星形胶质细胞,作用机制可能是通过N-cadherin蛋白介导的,激活PI3K/Akt信号通路完成。HS-4与FGF-2能协同诱导星形胶质细胞的活化,由静息态转变为活化态。具体表现为细胞形态变化,细胞增殖和迁移作用。HS-4诱导星形胶质细胞活化可能足通过活化ERK激酶,抑制Rho活性,使细胞骨架蛋白重组,细胞形态发生变化；ERK激酶活化核内的转录因子,如Cyc D1,细胞由G0/G1期向S期转变，促进细胞增殖。

全文目录


中文摘要  12-16
ABSTRACTS  16-21
符号说明  21-23
第一部分 前言  23-41
  1 神经干细胞移植治疗神经系统疾病  23-30
    1.1 神经干细胞的分布  24
    1.2 神经干细胞的生物学特性  24-25
    1.3 神经干细胞移植  25-30
      1.3.1 神经干细胞移植的细胞来源  25
      1.3.2 神经干细胞移植途径  25-27
      1.3.3 神经干细胞移植的应用  27-30
      1.3.4 神经干细胞移植亟待解决的问题  30
  2 星形胶质细胞在大脑神经损伤后的保护作用  30-37
    2.1 星形胶质细胞的经典生物学功能  31
    2.2 星形胶质细胞的内分泌及营养修复作用  31-32
    2.3 反应性星形胶质细胞对神经细胞的保护作用  32-35
      2.3.1 损伤缝合和组织重构  33
      2.3.2 局部免疫反应调控  33-34
      2.3.3 神经发生  34-35
    2.4 星形胶质细胞的逆分化作用  35-37
  3 海参多糖及其药理活性研究进展  37-40
    3.1 海参多糖成分概况  37-38
    3.2 海参多糖主要药理活性及临床应用  38-40
      3.2.1 抗凝血和溶栓  38-39
      3.2.2 抗病毒  39
      3.2.3 其他作用  39-40
  4 本课题研究的目的和意义  40-41
第二部分 刺参多糖促进神经球细胞迁移和分化作用的研究  41-71
  1 材料  42-48
    1.1 实验仪器  42-43
    1.2 实验耗材  43
    1.3 实验材料  43
    1.4 实验动物  43
    1.5 试验试剂  43-45
    1.6 引物序列  45
    1.7 主要溶液及试剂配方  45-48
  2 方法  48-56
    2.1 刺参多糖的分离纯化和理化性质鉴定  48-49
      2.1.1 刺参粗多糖的提取  48
      2.1.2 粗多糖的脱色  48
      2.1.3 刺参粗多糖的纯化和活性筛选实验  48-49
      2.1.4 HS-3理化性质的鉴定  49
    2.2 HS-3诱导神经球细胞迁移的作用及机制研究  49-56
      2.2.1 神经干细胞的分离和培养  49-50
      2.2.2 神经干细胞球的传代  50
      2.2.3 神经干细胞多向分化潜能的鉴定  50
      2.2.4 药物处理  50-51
      2.2.5 神经球迁移距离的测定  51
      2.2.6 免疫荧光染色  51
      2.2.7 BrdU检测细胞增殖情况  51-52
      2.2.8 Hoechst/PI双染  52
      2.2.9 Western blotting  52-53
      2.2.10 RT-PCR  53-55
      2.2.11 数据统计  55-56
  3 结果  56-68
    3.1 刺参多糖的纯化、活性筛选和理化性质鉴定  56-59
      3.1.1 刺参多糖的DEAE离子交换层析  56-57
      3.1.2 刺参多糖组分的活性筛选  57
      3.1.3 刺参多糖的凝胶层析分离  57-58
      3.1.4 HS-3理化性质的鉴定  58-59
    3.2 HS-3促进神经球细胞迁移和分化作用的研究  59-68
      3.2.1 神经细胞球的培养  59-60
      3.2.2 神经球干细胞特性鉴定  60-61
      3.2.3 刺参多糖(HS-3)诱导神经球粘附和迁移  61-62
      3.2.4 HS-3对神经球细胞增殖作用  62-63
      3.2.5 HS-3维持神经球细胞存活的作用  63-64
      3.2.6 HS-3诱导神经球细胞的分化作用  64-66
      3.2.7 HS-3诱导神经球粘附迁移分化可能的作用机制  66-68
  4 讨论  68-70
  5 本章小结  70-71
第三部分 刺参多糖促进星形胶质细胞活化作用机制的研究  71-94
  1 材料  72-73
    1.1 实验仪器  72
    1.2 实验耗材  72
    1.3 实验动物  72
    1.4 试验试剂  72-73
    1.5 主要溶液及试剂配方  73
  2 方法  73-75
    2.1 星形胶质细胞的分离和培养  73-74
    2.2 药物处理  74
    2.3 MTT试验  74
    2.4 伊红染色  74
    2.5 流式细胞术检测细胞周期  74-75
    2.6 Transwell实验  75
    2.7 数据统计  75
  3 结果  75-87
    3.1 HS-4的理化性质  75
    3.2 星形胶质细胞的培养  75-76
    3.3 HS-4对星形胶质细胞存活的影响  76-77
    3.4 HS-4诱导星形胶质细胞形态学的变化  77-78
    3.5 HS-4促进星形细胞的增殖作用  78-82
    3.6 HS-4诱导静止期星形胶质细胞进入S期  82-83
    3.7 HS-4和FGF-2协同诱导细胞活化信号通路的筛选  83-85
    3.8 HS-4和FGF-2通过ERK信号通路诱导星形胶质细胞活化  85-86
    3.9 HS-4和FGF-2诱导星形胶质细胞的迁移作用  86-87
  4 讨论  87-92
  5 本章小结  92-94
全文总结  94-96
参考文献  96-106
发表论文一 Morph ological transformation and proliferation of rat astrocytes asinduced by sulfated polysaccharides from the sea cucumber Stichopus japonicus  106-112
发表论文二 Sulfated Polysaccharide isolated from the sea cucumber Stichopusjaponicus promotes Neurosphere migration and differentiation via up-regulationof N-cadherin  112-120
致谢  120-121
博士期间发表的论文  121-122
学位论文评阅及答辩情况表  122

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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