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调控抗病毒天然免疫的miRNA筛选及其作用机制研究

作　者: 徐铮
导　师: 陈焕春
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: miRNA 负调控 Ⅰ型干扰素信号通路 JAK-STAT信号通路
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

天然免疫系统是宿主抵抗病原微生物的第一道防线,也是获得性免疫的基础。干扰素信号通路作为机体抵抗病毒感染所作出的重要应答机制,一直是病毒学和免疫学领域的研究热点。miRNA作为一种转录后水平的基因调控机制,广泛参与时序发育、神经元发育、细胞凋亡、细胞分化、脂肪代谢、激素分泌等多种生命过程。近年来的研究发现,miRNA在天然免疫系统中也发挥着重要的负反馈调控功能。本研究选择了抗病毒天然免疫信号通路中的几个关键信号分子作为对象,希望通过发掘靶向这些关键基因的miRNA,加深对miRNA参与的负调控机制的认识。为今后miRNA的功能研究和开发miRNA作为疾病诊断和治疗的靶标提供理论依据。具体研究内容包括以下几方面：1.筛选poly (d AT:d AT)诱导的差异表达miRNA及其功能研究dsRNA/DNA、细菌的内毒素脂多糖和细菌的鞭毛可以被宿主的免疫系统的模式识别受体识别并触发免疫反应。LPS和dsRNA触发的免疫反应所引起的miRNA差异表达及这些miRNA在免疫反应过程中的功能已经被发现和确定。但是,作为病毒在感染侵入宿主细胞复制过程中产生的中间产物,dsDNA刺激诱导的miRNA的差异表达研究尚不清楚。为了筛选dsDNA诱导的显著差异表达的miRNA,本研究选用dsDNA的模拟物poly(dAT:dAT)作为刺激物,通过：miRNA芯片技术,筛选了poly(dAT:dAT)刺激HEK-293细胞后差异表达的miRNA。发现miR-518b,miR-492,miR-181a和miR-331-3p等10条miRNA的表达显著上调；miR-383,miR-618,let-7a等5条miRNA的表达显著下调。利用miRNA特异性Real-Time PCR验证了芯片结果。通过靶基因预测和荧光素酶报告系统验证,发现其中上调表达的miR-181a可能通过靶向DAI基因负性调节干扰素信号通路。2.筛选调控IL-6基因表达的]miRNA及其机制研究白细胞介素6(IL-6)是一种重要的炎性细胞因子。细胞在受到致炎性刺激时,IL-6的表达量显著上调,并促进其它炎性细胞因子或者趋化因子的分泌,从而加重炎症反应,加速外源异物的清除。但是IL-6表达的紊乱对机体是有损害的,过量的IL-6会导致持续的炎症,并可能最终导致持续炎症组织发生癌变。因此,维持IL-6正常表达的负调控机制就显得至关重要。据此,本研究利用生物信息学方法,预测可能结合于IL-63’UTR区域的miRNA。利用荧光素酶报告系统,筛选到负调控IL-6表达的miR-365。通过构建IL-63’UTR突变体的报告质粒,确定了miR-365结合于IL-63’UTR的精细位点。利用ELISA方法,证实miR-365可以从蛋白水平对IL-6进行负调控,而且这种负调控是通过抑制IL-6蛋白的翻译而不是影响其mRNA的稳定性来实现的。对miR-365启动子区域的分析,发现NF-KB和Spl两个转录因子协同调控miR-365的转录。利用MAPK/ERK的抑制剂发现MAPK/ERK是miR-365上游重要的信号通路。进-步对miR-365潜在靶基因进行分析,发现miR-365还可能通过间接途径调控IL-6的表达。3.筛选靶向TBK-1的miRNA及其机制研究TBK-1是Ⅰ型干扰素信号通路中的重要信号分子,主要功能是磷酸化转录因子IRF3和IRF7,促进它们的转定位并最终启始IFN-p的转录。TLR或RIG-I/MDA5依赖的抗病毒信号通路在TBK-1/IRF3节段交汇,充分说明TBK-1激酶在整个抗病毒免疫系统中不可替代的重要性。为了发掘可能通过靶向TBK-1负调控干扰素信号通路的miRNA,本研究通过生物信息学预测miR-155可能靶向TBK-1,利用TBK-1-3’UTR的报告质粒证实了miR-155对TBK-1表达的抑制作用；过表达miR-155显著抑制TBK-1蛋白的表达,而miR-155抑制剂则增强TBK-1蛋白的表达,进一步证实了miR-155对TBK-1表达的负调控作用。利用TBK-13’UTR的突变体报告质粒,确定了miR-155与TBK-13’UTR区域的精确结合位点。在证实miR-155对TBK-1的负调控作用后,进一步利用IRF3、NF-κB和IFN-β的启动子荧光素报告质粒,证实miR-155过表达显著抑制IRF3和NF-κB的活性,并最终抑制IFN-β的转录。对TBK-1的Knockdown和Gain-of function assay的实验结果也证实miR-155负调控干扰素信号通路是通过靶向TBK-1而实现的。为了进一步证实miR-155对干扰素表达的抑制作用,检测了miR-155过表达对VSV和SEV增殖的影响,发现miR-155可通过抑制1poly(dAT:dAT)诱导的干扰素表达而促进VSV和SEV在HEK-293中的增殖。研究还发现poly(dAT:dAT)刺激显著诱导miR-155的表达,且NF-KB和MAPK是调控miR-155表达的重要通路。这些结果表明,可诱导的miR-155的表达在Ⅰ型干扰素信号通路中扮演着重要的负调控机制。4.筛选靶向JAK-1的miRNA及其机制研究JAK-STAT信号通路是连接干扰素和下游干扰素刺激基因的重要信号通路。JAK-1是Janus非受体型络氨酸激酶家族的成员之一。干扰素与细胞表面受体结合后,JAK-1磷酸化STAT家族中的两个成员STAT-1和STAT-2,促使其发生向细胞核的转定位并诱导干扰素刺激基因的转录激活。除干扰素之外,JAK-1在IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-13等细胞因子的信号转导通路中也发挥重要功能。到目前为止,还没有关于miRNA调控JAK-1表达的报道。为了发掘靶向JAK-1的miRNA,本研究预测并证实miR-23a通过直接与3’UTR结合的方式负调控JAK-1基因的表达。通过结合位点的突变分析,确定了miR-23a和JAK-1相互作用的精细位点。同时,发现miR-23a过表达显著抑制JAK-1的蛋白表达,且主要是通过降低mRNA的稳定性来实现的。过表达miR-23a对ISRE的活性及下游ISG的表达也有明显的抑制效应。用poly(dAT:dAT)刺激细胞,发现miR-23a的表达在刺激晚期显著上调,且NF-κB和MAPK/JNK信号通路可能是miR-23a上游的重要信号通路。这些结果表明,miR-23a可能在JAK-STAT信号通路中扮演着负反馈调控机制,以确保整条通路处于适度激活的状态。

全文目录

摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
缩略语表(Abbreviation)  13-16
第1章文献综述  16-44
  1.1 天然免疫反应中的信号识别受体  16-21
    1.1.1 TLR信号通路,配体和细胞生物学  16-18
    1.1.2 RIG-Ⅰ-样受体的配体及其功能  18-20
    1.1.3 识别病原和内源性配体：NLRs和CLRs  20-21
  1.2 抗病毒的天然免疫  21-27
    1.2.1 Ⅰ型干扰素基因的转录调控  22-23
    1.2.2 TLR依赖的抗病毒信号通路  23-25
    1.2.3 抗病毒天然免疫中的RIG-Ⅰ信号通路  25-27
  1.3 Ⅰ型干扰素和JAK-STAT信号通路  27-33
    1.3.1 干扰素基因及其编码的蛋白  28
    1.3.2 干扰素的信号传导和干扰素诱导基因的转录激活  28-32
    1.3.3 细胞内负调控干扰素通路的机制  32-33
    1.3.4 干扰素诱导的基因及其抗病毒效应  33
  1.4 miRNA和免疫系统  33-40
    1.4.1 miRNA的生物合成  33-34
    1.4.2 miRNA作为免疫系统的调控子  34-38
    1.4.3 炎性疾病中的miRNA表达失调  38-39
    1.4.4 miRNA在抗病毒免疫中的功能  39-40
  1.5 miRNA的研究方法  40-44
    1.5.1 基于杂交技术检测miRNA的表达  40-41
    1.5.2 基于PCR的方法检测miRNA的表达  41-42
    1.5.3 研究miRNA的生物信息学方法  42
    1.5.4 研究miRNA功能的实验室方法  42-44
第2章研究目的与意义  44-45
第3章材料与方法  45-55
  3.1 实验材料  45-49
    3.1.1 毒株与菌株  45
    3.1.2 细胞以及转染相关材料  45
    3.1.3 载体构建所需材料及获赠载体  45-48
    3.1.4 Western Blot所需材料  48
    3.1.5 分子生物学分析软件  48-49
  3.2 实验方法  49-55
    3.2.1 质粒的构建  49-50
    3.2.2 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达  50-51
    3.2.3 VSV-GFP和仙台病毒的增殖  51
    3.2.4 荧光定量RT-PCR检测基因mRNA和miRNA水平  51-54
    3.2.5 双荧光素酶报告系统  54
    3.2.6 流式细胞仪检测  54
    3.2.7 统计学方法  54-55
第4章结果与分析  55-115
  4.1 筛选poly(dAT：dAT)诱导的差异表达miRNA及其功能研究  55-65
    4.1.1 最佳细胞系的确定  55-56
    4.1.2 最佳刺激剂量和时间的确定  56-58
    4.1.3 芯片实验及Real-Time PCR对芯片数据的验证  58-61
    4.1.4 差异性表达miRNA的靶基因预测及功能验证  61-65
  4.2 筛选靶向IL-6基因的miRNA及其机制研究  65-82
    4.2.1 预测和筛选靶向IL-6基因的miRNA  65-68
    4.2.2 miR-365抑制IL-6的蛋白翻译但并不降解mRNA  68-69
    4.2.3 miR-365与IL-6 3’UTR作用位点的确定  69-71
    4.2.4 miR-365启动子报告质粒的构建  71-73
    4.2.5 转录因子Spl和NF-κB是miR-365启动子活性所必需的  73-76
    4.2.6 Sp1和NF-κB协同调控miR-365的转录  76-78
    4.2.7 MAPK/ERK信号通路参与调控miR-365转录  78-79
    4.2.8 miR-365较let-7a具有更强的负调控IL-6表达的能力  79-82
  4.3 筛选靶向TBK-1基因的miRNA及其机制研究  82-103
    4.3.1 靶向TBK-1的miRNA的预测及miR-155作用位点的确定  82-86
    4.3.2 miR-155抑制TBK-1的蛋白翻译而并不降解其mRNA  86-88
    4.3.3 miR-155负调控IRF3和NF-KB的活性  88-90
    4.3.4 miR-155通过靶向TBK-1负调控IFN信号通路  90-93
    4.3.5 TBK-1的磷酸激酶活性可以抑制miR-155的负调控功能  93-94
    4.3.6 miR-155抑制ISRE的活性并抑制ISGs的表达  94-96
    4.3.7 miR-155通过抑制IFN的分泌促进VSV和Sendai Virus的增殖  96-99
    4.3.8 miR-155的可诱导表达受NF-KB和MAPK信号通路调控  99-101
    4.3.9 miR-155和癌症和免疫信号通路存在紧密联系  101-103
  4.4 筛选靶向JAK-1基因的miRNA及其机制研究  103-115
    4.4.1 作用于JAK-1 3’UTR区域的miRNA预测  103-105
    4.4.2 miR-23a通过降低mRNA稳定性负调控JAK-1的蛋白表达  105-106
    4.4.3 miR-23a作用位点的确定  106-108
    4.4.4 miR-23a通过负调控JAK-1抑制JAK-STAT信号通路  108-113
    4.4.5 NF-κB和MAPK信号通路参与调控miR-23a的表达  113-115
第5章讨论与结论  115-126
  5.1 讨论  115-125
    5.1.1 筛选poly(dAT：dAT)诱导的差异表达miRNA及其功能研究  115-117
    5.1.2 筛选靶向IL-6基因的miRNA及其机制研究  117-119
    5.1.3 筛选靶向TBK-1基因的miRNA及其机制研究  119-122
    5.1.4 筛选靶向JAK-1基因的miRNA及其机制研究  122-125
  5.2 结论  125-126
参考文献  126-143
致谢  143-144
附录  144

调控抗病毒天然免疫的miRNA筛选及其作用机制研究

内容摘要

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