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福建柿子种质资源离体保存及其试管苗叶片SOD基因克隆

作　者: 朱伟玲
导　师: 赖钟雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 果树学
关键词: 柿 胚培养 离体保存 基因克隆 SODs
分类号: S665.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 57次
引　用: 1次
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内容摘要


柿树（Diospyros spp.）是重要的经济果树。本试验以福建省柿子为材料，进行胚培养研究并离体保存了30份柿子种质资源；同时，以油柿试管苗叶片为材料，克隆得到Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因家族28个转录本部分序列或全长。主要研究结果如下：1柿幼胚培养及试管苗的获得柿幼胚培养的最佳培养基为：MS+白糖30g.L-1+琼脂9g.L-1+活性炭0.5g.L-1。其中促进株高生长的培养基为MS+白糖30g.L-1+琼脂5g.L-1+活性炭1g.L-1；能够分化出更多根数的培养基为MS（1/2N）+白糖45g.L-1+琼脂9g.L-1+活性炭0.5g.L-1；促进根生长的培养基为MS+白糖15g.L-1+琼脂9g.L-1+活性炭0.5g.L-1；最有利于叶片生长的培养基为MS+白糖30g.L-1+琼脂7g.L-1+活性炭0.5g.L-1。0.5g.L-1的活性炭便能有效防止试管苗褐化，在幼胚培养过程发现了14.4%的“异常”植株。2柿成熟胚培养及试管苗的获得柿成熟胚培养的最佳培养基为：MS（1/2N）+白糖45g.L-1+琼脂9g.L-1+活性炭0.5g.L-1。其中促进株高生长的培养基为1/2MS+白糖45g.L-1+琼脂5g.L-1+活性炭0.5g.L-1；能够分化出更多根数的培养基为MS（1/2N）+白糖45g.L-1+琼脂9g.L-1+活性炭0.5g.L-1；促进根生长的培养基为MS（1/2N）+白糖15g.L-1+琼脂5g.L-1+活性炭0.5g.L-1；最有利于叶片生长的培养基为MS（1/2N）+白糖45g.L-1+琼脂9g.L-1+活性炭1g.L-1。发现成熟胚培养相较于幼胚来说，需要较低的矿质元素，并未发现玻璃化苗的存在，成熟胚培养的黄化率低于幼胚培养。3柿继代增殖培养和生根培养将柿胚培养得到的试管苗切除根部后，接入到含有TDZ、ZT和活性炭的培养基中培养，结果发现柿增殖的最佳培养基为：MS（1/2N）+白糖30g.L-1+琼脂7g.L-1+ZT2mg.L-1+TDZ2mg.L-1+活性炭0.5g.L-1。最适宜的生根培养基为：MS（1/2N）+白糖30g.L-1+琼脂7g.L-1+TDZ1mg.L-1+活性炭0.5g.L-1。我们发现ZT能有效促进柿子增殖，而活性炭不仅能够有效防止褐化，还能促进生根。4柿愈伤组织培养和分化适合柿子叶片诱导愈伤组织的最佳培养基为：MS（1/2N）+蔗糖30g.L-1+琼脂7g.L-1+2,4-D0.2mg.L-1+TDZ0.2mg.L-1+ZT1mg.L-1。将愈伤组织转接到Ms（1/2N）+TDZ1.0mg.L-1培养基中能获得较高的分化率。此外，野生柿愈伤组织形成时间稍早于油柿，且分化能力远远超过油柿。愈伤组织的培养和分化过程中，均存在不同程度的褐化现象。5柿子种质资源的离体保存收集了30份福建省柿子种质资源，采取MS（1/2N）基本培养基与添加ZT1.0mg.L-1的培养基进行交替培养能够保存5个月以上。在培养过程中，发现野生柿不会出现黄化苗，而在栽培柿油柿幼胚和成熟胚培养过程中会出现百分之十几的黄化苗。且在保存过程中，栽培柿和野生柿均会出现一定程度的茎尖枯死和落叶现象，直接影响了保存时间和成活率。6Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因的克隆6.1油柿试管苗Fe-SOD基因的克隆以油柿试管苗叶片为材料，克隆得到1条FSD基因全长序列，即Do-FSD（JQ797750），该序列全长为885bp，编码209个氨基酸。根据生物信息学分析，我们可以推测Do-FSD为不稳定亲水蛋白，属于非分泌蛋白，不含信号肽，定位于细胞质的可能性比较大，以丝氨酸为主，酪氨酸和苏氨酸为辅的磷酸化方式，通过影响蛋白酶的专一性、活性和分子构象等，参与调控油柿试管苗过氧化物代谢等过程。并获得1条油柿FSD基因保守序列（JN997420）和5条油柿FSD基因转录本Do-FSD1、Do-FSD2、Do-FSD3、Do-FSD4、Do-FSD5（JQ797745、JQ797746、JQ797747、JQ797748、JQ797749）。6.2油柿试管苗Mn-SOD基因转录本的获得以油柿试管苗叶片cDNA第一链为模板，克隆得到11个MSD转录本，其中Do-MSD1、Do-MSD2、Do-MSD3、Do-MSD4、Do-MSD5、Do-MSD6、Do-MSD7、Do-MSD8、Do-MSD9、Do-MSD10，登录号为JQ797735至JQ797744，且可能都是油柿试管苗叶片MSD基因家族的多个成员，同时存在3’UTR存在多态性。并且Do-MSD1与其保守序列（JQ245697）拼接后能翻译一种功能未知蛋白DUF3767。6.3油柿试管苗Cu/Zn-SOD基因转录本的获得在对油柿（Diospyros oleifera）CSD基因进行TA克隆时，使用同一对引物克隆得到2条长为227bp的保守序列（Do-CSD1、Do-CSD2），但二者核苷酸差异较大，编码的氨基酸也存在较大差异。在Do-CSD1（JQ002570）和Do-CSD2（JQ797751）序列相同处和差异处设计不同引物，获得的8条长度不一、核苷酸及氨基酸序列均存在一定程度上的差异的3’端序列，分别命名为Do-CSD3、Do-CSD4、Do-CSD5、Do-CSD6、Do-CSD7、Do-CSD8、Do-CSD9、Do-CSD10（登录号分别为：JQ797752、JQ797753、JQ797754、JQ797755、JQ797756、JQ797757、JQ797758、JQ797759）。推测油柿CSD基因多个转录本的获得可能是由于可变剪接引起的。

全文目录


缩写词  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章 引言  13-26
  1 植物种质资源离体保存研究进展  13-16
    1.1 种质资源保存方法及其优缺点  13-14
    1.2 植物离体种质保存的应用  14-16
  2 柿子生物技术研究进展  16-21
    2.1 离体培养  16-18
    2.2 柿子种质资源离体保存进展  18-19
    2.3 柿子分子生物学研究进展  19-21
  3 SOD 基因研究进展  21-24
    3.1 SOD 基因的生物学功能  21-24
    3.2 植物 SOD 基因克隆研究进展  24
  4 本研究的意义及内容  24-26
    4.1 本研究的意义  24-25
    4.2 本研究的主要内容  25-26
第二章 柿子胚培养与试管苗的获得  26-62
  第一节 油柿幼胚培养与试管苗的获得  26-45
    1 材料与方法  26-27
    2 结果与分析  27-44
    3 讨论  44-45
  第二节 油柿成熟胚培养与试管苗的获得  45-62
    1 材料与方法  45-46
    2 结果与分析  46-60
    3 讨论  60-62
第三章 柿子试管苗的继代增殖培养与生根培养  62-71
  1 材料与方法  62
  2 结果与分析  62-69
  3 讨论  69-71
第四章 柿子的愈伤组织培养与分化  71-78
  第一节 柿子的愈伤组织诱导  71-75
    1 材料与方法  71-72
    2 结果与分析  72-75
    3 讨论  75
  第二节 柿子愈伤组织分化  75-78
    1 材料与方法  75-76
    2 结果与分析  76-77
    3 讨论  77-78
第五章 柿子种质资源的离体保存  78-82
  1 材料与方法  78-79
  2 结果与分析  79-80
  3 讨论  80-82
第六章 柿子试管苗叶片 Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD 基因克隆  82-105
  第一节 柿子试管苗叶片 Fe-SOD 基因克隆  82-94
    1 材料与方法  83
    2 结果与分析  83-93
    3 讨论  93-94
  第二节 柿子试管苗叶片 Mn-SOD 基因克隆  94-99
    1 材料与方法  94-95
    2 结果与分析  95-98
    3 讨论  98-99
  第三节 柿子试管苗叶片 CuZn-SOD 基因克隆  99-105
    1 材料与方法  100
    2 结果与分析  100-103
    3 讨论  103-105
第七章 小结  105-108
参考文献  108-123
附录 1 图版  123-132
附录 2 油柿试管苗铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)基因转录本序列登录 Genbank 信息  132-141
附录 3 油柿试管苗铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)基因转录本序列登录 Genbank 信息  141-153
附录 4 油柿试管苗锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因转录本序列登录 Genbank 信息  153-167
致谢  167

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 杂果类 > 柿
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