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苏云金芽胞杆菌芽胞期调控因子和Cry蛋白表达关系的研究

作　者: 王新梅
导　师: 李杰
学　校: 东北农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 spoⅢD基因突变株 cry基因启动子转录活性 Cry蛋白表达量 sRNA
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),革兰氏阳性菌,芽胞杆菌属,其最明显的特征是在芽胞形成的同时会产生具有杀虫作用的晶体,对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目等农林业害虫具有特异性杀虫活性,是目前国际上应用最广泛最成功的微生物杀虫剂。晶体主要由杀虫晶体蛋白组成,杀虫晶体蛋白由cry或cyt基因编码。前人对不同类型的cry基因启动子的表达调控机制进行了较深入的研究,但对不同启动子的活性比较还未见报道。本研究比较了crylAc、cry3Aa、cry4A和cry8Ea基因启动子在芽胞期母细胞调控因子spoⅢD突变体中的活性,并对芽胞形成相关基因的sRNA进行了初步分析。通过p-半乳糖苷酶活性测定说明spoⅢD突变对crylAc和cry8E基因启动子转录活性没有显著影响,对cry3A启动子转录活性略有提高,而对cry4A基因启动子影响较大。HD-73菌株中Pcry8E转录活性最高,Pcry4A次之,然后是PcrylAc, Pcry3A转录活性最低。在HD-ASpoIIID菌株中四个启动子的转录活性高低顺序与HD-73野生型菌株中一致,Pcrv8E转录活性在HD-73菌株和spoⅢD突变株都是最高的。利用660nm蛋白定量试剂盒对上清液中总蛋白定量,取相同蛋白量上样,进行SDS-PAGE电泳。结果表明,在HD-ASpoIIID菌株中,总蛋白量相同的条件下,PcrylAc、 Pcry8E指导的crylAc蛋白产量较高,Pcry4A次之,Pcry3A指导的CrylAc蛋白产量最低。对小菜蛾的室内生物活性,与不同启动子指导的蛋白产量的分析结果一致。为了分析crylAc野生拷贝对不同cry启动子指导crylAc基因表达的影响,在spoⅢD突变体基础上通过高温缺失了pHT73大质粒,获得了无晶体无芽胞突变体HD--ASpoIIID.在HD’-ASpoIIID菌株中,总蛋白量相同的条件下,PcrylAc、Pcry8E指导的crylAc蛋白产量较高,Pcry4A次之,Pcry3A指导的PcrylAc蛋白产量最低,与HD-SpoIIID菌株中的蛋白表达情况一致。说明含有crylAc野生拷贝对于分析不同cry类型启动子强弱无显著的影响。通过上述分析筛选出了在HD-ASpoIIID菌株中适合表达外源基因的高活性启动子cry8E基因的启动子,为构建高效表达体系奠定了基础,同时也为新农药的开发提供了表达元件。对SM培养基中野生型菌株T0,T3,T7时期RNA混合样品进行30nt左右片段测序,对所得数据进行生物信息学分析,得到了15个芽胞形成与发育有关基因的候选sRNA。通过RT-PCR对候选sRNA转录活性以及上下游基因之间的关系分析初步确定了一个sRNA。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 引言  11-29
  1.1 苏云金芽胞杆菌概述  11-12
  1.2 芽胞期调控因子  12-14
    1.2.1 早期母细胞中的sigma因子σ~E  12-13
    1.2.2 转录调节因子SpoⅢD  13
    1.2.3 芽胞形成的晚期的σ~K因子  13
    1.2.4 转录调节因子GerE  13-14
  1.3 Bt杀虫蛋白  14-16
    1.3.1 Bt杀虫蛋白基因  14
    1.3.3 Bt杀虫蛋白基因的分类  14-16
  1.4 Bt杀虫蛋白的表达调控  16-24
    1.4.1 转录水平调控  16-20
    1.4.2 mRNA的稳定性  20-21
    1.4.3 cry基因的拷贝数  21-22
    1.4.4 辅助蛋白  22-24
  1.5 small RNA  24-27
    1.5.1 small RNA简介  24-25
    1.5.2 sRNA的作用机理  25
    1.5.3 芽胞杆菌中sRNA的研究概况  25-27
  1.6 本研究的立题依据和目的意义  27-29
2 材料与方法  29-42
  2.1 实验材料  29-33
    2.1.1 菌株与质粒  29
    2.1.2 培养基和抗生素  29-30
    2.1.3 主要试剂和仪器  30
    2.1.4 引物序列  30-32
    2.1.5 常用溶液和缓冲液  32-33
  2.2 仪器设备  33-34
  2.3 研究方法  34-42
    2.3.1 PCR扩增  34-35
    2.3.2 转录活性分析载体的构建  35-36
    2.3.3 β-半乳糖苷酶活性分析  36
    2.3.4 HD~--△SpoⅢD突变体的筛选  36
    2.3.5 融合表达载体的构建  36-37
    2.3.6 不同启动子指导的Cry1Ac蛋白产量分析  37-39
    2.3.7 室内生物活性测定  39
    2.3.8 生物信息学分析软件  39
    2.3.9 RNA的提取和纯化  39-40
    2.3.11 反转录PCR  40-42
3 结果与分析  42-56
  3.1 cry基因启动子转录活性比较  42
  3.2 spoⅢD基因缺失对cry基因启动子转录活性影响  42-44
  3.3 不同cry基因启动子指导的Cry1Ac蛋白产量分析  44-46
    3.3.1 标准曲线的绘制  44-45
    3.3.2 总蛋白量定量  45
    3.3.3 蛋白产量的分析  45-46
  3.4 室内生物活性分析  46-47
  3.5 无晶体spoⅢD突变体的筛选  47-48
  3.6 cry启动子指导cry1Ac基因在无晶体spoⅢD突变体中的产量分析  48-49
    3.6.1 总蛋白量定量  48-49
    3.6.2 蛋白产量的分析  49
  3.7 苏云金芽胞杆菌芽胞相关基因sRNA的生物信息学分析  49-52
  3.8 Bt总RNA的提取  52-53
  3.9 RT-PCR鉴定候选sRNA转录活性  53-56
4 讨论  56-57
5 结论  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-67
攻读硕士学位期间发表的学术论文  67

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