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产苦马豆素真菌的分离鉴定及发酵条件优化

作　者: 马尧
导　师: 赵宝玉；路浩
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 苦马豆素 内生真菌 ITS序列 发酵优化 疯草
分类号: Q93;R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


苦马豆素(Swainsonine,SW)属吲哚里西啶类生物碱,是疯草类有毒植物的主要毒性成分,长期采食含苦马豆素的疯草类植物会引起动物中毒,给国内外草原畜牧业带来很大危害。近期研究表明苦马豆素具有抗肿瘤、提高免疫能力,抑制癌细胞转移等生物活性,成为近几年筛选新型抗肿瘤药物的热点。但由于苦马豆素来源不足,严重制约了对其药用研发进度。1985年美国研究人员Braun从绿僵菌中分离获得苦马豆素纯品,随后许多学者从多种疯草分离到可产生苦马豆素的内生真菌,并对疯草苦马豆素与内生真菌关系进行了深入研究,发现内生真菌与疯草苦马豆素产生有着密切的联系。微生物发酵生产天然活性物质具有成本低、可控性高、生产周期短等优点,因此,利用产苦马豆素真菌发酵生产苦马豆素,可为解决苦马豆素来源问题提供一条新的途径。我国西北内蒙古、青海等地分布有大量疯草,这些地区疯草中是否寄生有产苦马豆素的内生真菌,国内相关报道很少。本研究通过对采自青海、内蒙古地区疯草及其根际土壤中真菌的分离、筛选可产生苦马豆素的真菌、用形态学和分子生物学方法对菌株种属进行鉴定、以及优化菌株产苦马豆素的发酵条件,为苦马豆素药用来源及疯草微生物多样性研究提供了重要理论依据。研究取得以下结果:1.疯草内生真菌及其根际土壤真菌的分离筛选采用组织分离法和梯度稀释法对采集的疯草样品中的内生真菌及根际土壤真菌进行分离,将得到的菌株纯化培养;纯化后的菌株进行发酵培养,应用薄层层析(Thin Layer Chromatography, TLC)和气相色谱法(Gas Chromatography, GC)分别对菌丝及发酵液中SW进行检测,筛选可产生SW的真菌,并测定其苦马豆素产率。筛选得到2株可产生SW的真菌,其中一株为甘肃棘豆内生真菌,一株为土壤真菌,分别命名为FS5和FEG7,气相色谱测得菌丝中SW含量分别为:0.773 mg/g和0.11 mg/g。与西北农林科技大学资源与环境学院来航线副教授分离得到的两株真菌EFG-8和B-1合并,其苦马豆素产率分别为:1.578 mg/g和0.047 mg/g。2.产苦马豆素真菌的鉴定及保藏菌株的鉴定采用形态学观察和分子生物学两种方法进行。菌株形态主要观察培养过程中的菌丝、产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等特征,参考《真菌鉴定手册》进行鉴定。分子生物学鉴定是用改良CTAB法提取菌株DNA,采用White设计的真菌通用引物,ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCT-3’)和ITS2(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。将扩增得到的序列用1 %琼脂糖凝胶电泳检测,胶回收纯化目的片段,连接至pMD-18T载体,转化大肠杆菌DH5α,经菌落PCR、质粒酶切鉴定的阳性克隆,测定序列。以NCBI数据库中blast程序比对分析,用Mega 4.0软件Clustal W方法进行聚类分析。菌种的保藏采用甘油保存法和石蜡油保存法。经过鉴定,FS-5、EFG-7、EFG-8、B-1分别是裂褶菌属、三线镰刀菌、曲霉属、褶皱裸孢壳菌;另外,采用油管法进行菌种保藏,以利于今后长期使用。3.产苦马豆素真菌的发酵优化采用正交试验方法对EFG-8和B-1菌株生长的碳源、氮源、基础培养基进行优化,指标为菌丝生长速度;但由于菌丝生长速度不能直接反映其产苦马豆素的变化,因此又设置两个试验,采用菌株液体发酵方法,分别对影响苦马豆素产量的营养因子和环境因子进行优化,包括时间、温度、装样量、pH。然后对发酵产物进行气相色谱分析,测量出发酵液中苦马豆素的含量,最后对所得数据进行统计分析,找到适合菌株的最佳发酵条件。最终确定EFG-8和B-1产苦马豆素的优势培养基和发酵环境,EFG-8的为10 %豆粕,6 %蛋白胨,10 %葡萄糖,发酵时间4周,温度28℃,装样量250 mL,pH6;B-1的优化结果为:10 %豆粕,10 %葡萄糖,4 %硝酸钾,发酵时间2周,温度28℃,装样量250 mL,pH6。

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-12
前言  12-13
文献综述  13-41
  第一章 国内外内生真菌研究进展  13-29
    1.1 内生真菌的定义  13
    1.2 内生真菌研究历史  13-14
    1.3 内生真菌分布规律  14-15
    1.4 内生真菌的生物多样性  15-16
    1.5 内生真菌的专一性  16-18
      1.5.1 宿主专一性  16
      1.5.2 组织专一性  16-18
    1.6 内生真菌的生物学及生态学意义  18-24
      1.6.1 促进宿主植物生长发育  18-20
      1.6.2 增强宿主植物抗逆性  20-23
      1.6.3 不同生物间的“基因水平传递”  23-24
    1.7 内生真菌的代谢产物  24-28
      1.7.1 抗癌类物质  24-26
      1.7.2 抗菌类物质  26-27
      1.7.3 杀虫类物质  27-28
      1.7.4 植物生长调节剂类物质  28
    1.8 内生真菌研究展望  28-29
  第二章 国内外疯草及疯草内生真菌研究进展  29-41
    2.1 疯草与疯草毒素—苦马豆素研究概况  29-36
      2.1.1 疯草的定义和分布  29-30
      2.1.2 疯草的生物学特性  30-31
      2.1.3 疯草的中毒学研究  31
      2.1.4 疯草毒素的研究  31-32
      2.1.5 苦马豆素的理化性质  32
      2.1.6 苦马豆素的药用活性  32-34
      2.1.7 苦马豆素的来源及当前研究困境  34-35
      2.1.8 疯草的综合治理  35-36
    2.2 苦马豆素与疯草内生真菌  36-37
    2.3 疯草内生真菌的分布特点  37-38
      2.3.1 在植株内的分布特点  37
      2.3.2 在不同疯草中的分布特点  37-38
    2.4 疯草内生真菌的传播方式  38-39
    2.5 疯草内生真菌与其宿主的相互影响  39-40
      2.5.1 促进疯草生长与抗逆性  39-40
      2.5.2 减少动物采食  40
    2.6 疯草内生真菌研究展望  40-41
试验研究  41-77
  第三章 疯草内生真菌及其根际土壤真菌的分离筛选  41-52
    3.1 试验材料及仪器试剂  41-44
      3.1.1 试验材料  41-43
      3.1.2 主要试剂  43
      3.1.3 主要仪器  43-44
    3.2 试验方法  44-45
      3.2.1 疯草内生真菌分离方法  44
      3.2.2 疯草根际土壤真菌分离方法  44
      3.2.3 菌株发酵及发酵产物中苦马豆素的提取方法  44
      3.2.4 薄层色谱检测方法  44-45
      3.2.5 气相色谱检测方法  45
    3.3 试验结果  45-50
      3.3.1 真菌分离结果  45-48
      3.3.2 菌株发酵结果  48
      3.3.3 发酵产物薄层色谱检测结果  48-49
      3.3.4 发酵产物气相色谱检测结果  49-50
    3.4 讨论  50-51
      3.4.1 疯草样品采集运输  50
      3.4.2 菌株产苦马豆素机理  50-51
    3.5 小结  51-52
  第四章 产苦马豆素真菌的鉴定及保藏  52-64
    4.1 试验材料及仪器试剂  52
      4.1.1 试验材料  52
      4.1.2 主要试剂  52
      4.1.3 主要仪器  52
    4.2 试验方法  52-56
      4.2.1 产孢培养基的制作及菌株形态观察  52
      4.2.2 真菌DNA 提取方法  52-53
      4.2.3 真菌ITS 序列扩增及其克隆测序  53-55
      4.2.4 菌株ITS 序列系统发育树的构建  55
      4.2.5 菌株保藏方法  55-56
    4.3 试验结果  56-62
      4.3.1 菌株形态观察结果  56-57
      4.3.2 菌株ITS 序列扩增及测序结果  57-58
      4.3.3 菌株ITS 序列构建系统发育树的结果  58-61
      4.3.4 菌株保藏结果  61-62
    4.4 讨论  62-63
      4.4.1 ITS 序列用于真菌种属鉴定  62-63
      4.4.2 菌株保藏方法讨论  63
    4.5 小结  63-64
  第五章 产苦马豆素真菌的发酵条件优化  64-77
    5.1 试验材料及仪器试剂  64
      5.1.1 试验材料  64
      5.1.2 主要试剂  64
      5.1.3 主要仪器  64
    5.2 试验方法  64-67
      5.2.1 营养因子优化方法  64-66
      5.2.2 环境因子优化方法  66
      5.2.3 发酵产物中苦马豆素检测方法  66-67
    5.3 试验结果  67-75
      5.3.1 营养因子优化结果  67-69
      5.3.2 环境因子优化结果  69-71
      5.3.3 试验结果统计分析  71-75
    5.4 讨论  75-76
    5.5 小结  76-77
结论  77-78
参考文献  78-86
附录  86-98
致谢  98-99
作者简介  99

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药化学
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