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由井冈霉素、阿卡波糖及其衍生物制备维列胺的研究

作　者: 魏晓东
导　师: 赵文杰
学　校: 上海医药工业研究院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 维列胺阿卡波糖井冈霉素A α-糖苷酶抑制剂毛细管区带电泳生物转化
分类号: R943
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

维列胺是一个不饱和C7N氨基环醇,其结构类似α-D-葡萄糖,是各种α-糖苷酶抑制剂的核心结构,利用其N-取代物可合成其它活性更强的糖苷酶抑制剂。阿卡波糖和伏格列波糖可以竞争性抑制α-葡萄糖苷酶,减缓糖类的吸收,是临床上广泛使用的治疗II型糖尿病的降糖药物。维列胺除化学合成外,主要由含维列胺结构的化合物来制备。井冈霉素和阿卡波糖结构中都含有维列胺,可经生物转化或化学裂解产生维列胺。阿卡波糖化学裂解法迅速高效,不产生副产物井冈霉胺,但原料成本较高。井冈霉素生物转化产率低、周期长,会产生井冈霉胺。本文进行了由阿卡波糖和井冈霉素制备维列胺的研究。本文首先研究了维列胺、阿卡波糖和井冈霉素的检测方法,建立了毛细管区带电泳的分析方法,可同时对维列胺制备过程的底物和产物进行检测,极大提高了检测效率。本文通过酸、碱和离子交换树脂与阿卡波糖或井冈霉素反应,发现井冈霉素经酸、碱、离子交换树脂法都不能产生维列胺。三氟乙酸及离子交换树脂水解阿卡波糖能产生维列胺,但维列胺的产率较低。碱裂解阿卡波糖产生维列胺产率最高,阿卡波糖与NaOH质量比1∶4时,121℃裂解30min,维列胺产率最高可达84.2%。阿卡波糖发酵的衍生物杂质C,经NaOH裂解也得到了维列胺,转化率与阿卡波糖相同。从实验室菌种库中筛选了4株井冈霉素转化菌,其中SIPI-V08转化效果最好,SIPI-V01和SIPI-V29稍弱,SIPI-V23转化率最低。对它们进行了维列胺的生物转化研究,优化了转化液和转化条件。采用4株转化菌的静息细胞进行转化,维列胺的转化率没有显著提高。井冈霉素降解为维列胺是多步酶反应的过程,每步反应的酶活力都不相同,可能有一种酶成为限速酶。即使是催化同一步反应的酶,不同菌种的酶活力也有很大差异,当不同来源的菌种混合进行转化时,可能形成互补,提高总转化率。采用4株转化菌进行混合转化,结果发现部分组合的混合转化能显著提高转化率,高于各自单独转化的最高值。SIPI-V08-V23、SIPI-V01-V08、SIPI-V01-V08-V23的混合时转化效果最好。混合转化也能降低高浓度底物对菌种的抑制,在10%的底物浓度下也能迅速转化。10%底物浓度下静息细胞混合转化总转化率显著提高,转化周期比单独转化缩短一半,SIPI-V08-V23、SIPI-V01-V08-V23、SIPI-V01-V08组合3种组合的混合转化产生的维列胺在第3d就超过了SIPI-V08单独转化6d的5.0mg/ml。SIPI-V08-V23混合在第7d达10.4mg/ml,提高了近一倍。SIPI-V01-V08在第5d维列胺最高为9.2mg/ml。

全文目录

英文缩写说明  9-10
摘要  10-11
ABSTRACT  11-13
第1章文献综述  13-32
  1.1 糖尿病及酶抑制剂  13-15
    1.1.1 糖尿病及其治疗药物  13-14
    1.1.2 酶抑制剂作为药物的前景  14-15
  1.2 糖苷酶及糖苷酶抑制剂  15-17
  1.3 C_7N 氨基环醇类化合物  17-22
    1.3.1 维列胺和井冈霉胺  17-18
    1.3.2 阿卡波糖  18-19
    1.3.3 井冈霉素  19-20
    1.3.4 其它C_7N 氨基环醇类化合物  20-21
    1.3.5 C_7N 氨基环醇类化合物的活性  21-22
  1.4 维列胺的结构及性质  22-23
    1.4.1 化学结构  22
    1.4.2 理化性质  22
    1.4.3 生物活性  22-23
  1.5 维列胺的制备  23-28
    1.5.1 从井冈霉素的发酵液中提取  24
    1.5.2 化学合成维列胺  24
    1.5.3 化学裂解含维列胺结构的C_7N 氨基环醇化合物  24-25
    1.5.4 微生物转化法制备  25-28
  1.6 维列胺的应用前景  28-30
  1.7 混菌发酵  30-31
  1.8 本课题的研究目的和意义  31-32
第2章维列胺、阿卡波糖和井冈霉素的毛细管电泳及HPLC 检测  32-48
  2.1 文献检测方法  32-36
    2.1.1 阿卡波糖、井冈霉素和维列胺的文献检测方法  32-33
    2.1.2 高效液相色谱－蒸发光散射器检测  33-34
    2.1.3 毛细管电泳检测  34-36
  2.2 仪器与试剂  36-37
  2.3 溶液配制  37
    2.3.1 工作参照品的配制  37
    2.3.2 样品的制备  37
  2.4 实验方法  37-38
    2.4.1 维列胺的高效薄层层析TLC 检测  37
    2.4.2 阿卡波糖的HPLC 检测  37-38
    2.4.3 HPLC-ELSD 法检测阿卡波糖、井冈霉素转化产物维列胺  38
    2.4.4 毛细管电泳法检测阿卡波糖、井冈霉素转化产物维列胺  38
  2.5 实验结果  38-45
    2.5.1 薄层色谱法检测维列胺  38-39
    2.5.2 HPLC-ELSD 法检测维列胺、阿卡波糖和井冈霉素  39-40
    2.5.3 毛细管电泳法检测维列胺、阿卡波糖和井冈霉素  40-45
  2.6 讨论  45-46
  2.7 结论  46-48
第3章由阿卡波糖及其衍生物制备维列胺  48-62
  3.1 阿卡波糖发酵过程中的衍生物  48
  3.2 阿卡波糖制备维列胺的文献方法  48-50
    3.2.1 微生物转化法  49
    3.2.2 三氟乙酸法  49-50
    3.2.3 固体催化法  50
    3.2.4 碱裂解法  50
  3.3 材料与方法  50-51
    3.3.1 试剂与仪器  50
    3.3.2 实验方法  50-51
  3.4 实验结果  51-59
    3.4.1 微生物转化法  51
    3.4.2 酸水解法  51-53
    3.4.3 固体催化法  53-54
    3.4.4 碱裂解法  54-58
    3.4.5 阿卡波糖衍生物的碱裂解法制备维列胺及其应用  58
    3.4.6 维列胺的分离纯化方法  58-59
  3.5 讨论  59-60
  3.6 结论  60-62
第4章由井冈霉素制备维列胺  62-85
  4.1 由井冈霉素制备维列胺的文献方法  62
    4.1.1 溴代琥珀酰亚胺裂解井冈霉素制备维列胺  62
    4.1.2 微生物转化井冈霉素制备维列胺  62
  4.2 材料与方法  62-64
    4.2.1 菌种、仪器与试剂  62-63
    4.2.2 实验方法  63-64
  4.3 实验结果  64-82
    4.3.1 菌种的筛选  64-67
    4.3.2 种子培养基优化  67-68
    4.3.3 转化条件优化  68-72
    4.3.4 转化液优化  72-77
    4.3.5 不同菌种的混合培养转化  77-79
    4.3.6 静息细胞转化  79-80
    4.3.7 不同菌种的静息细胞混合转化  80-82
  4.4 讨论  82-83
  4.5 结论  83-85
第5章维列胺的分离纯化  85-90
  5.1 材料与方法  85-86
    5.1.1 材料  85
    5.1.2 弱酸性阳离子交换纯化  85
    5.1.3 脱色  85-86
    5.1.4 强碱性阴离子交换纯化  86
  5.2 实验结果  86-88
    5.2.1 弱酸性阳离子交换纯化  86-87
    5.2.2 脱色  87-88
    5.2.3 强碱性阴离子交换树脂纯化  88
  5.3 讨论  88-89
  5.4 结论  89-90
全文总结  90-93
本文创新点  93-95
对进一步研究工作的设想和建议  95-96
攻读学位期间发表的学术论文  96-97
参考文献  97-103
致谢  103

由井冈霉素、阿卡波糖及其衍生物制备维列胺的研究

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